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原发性肝癌（简称“肝癌”）是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第四大原因。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要形式，占患者的75%-85%。目前，手术切除肝癌治疗的首选方式，但术后5年内仍有60%-70%患者出现转移和复发，且术后2年早期复发占复发HCC病例的70%。这种复发几乎无治疗手段，严重影响影响患者长期生存。目前，我们对于与肝癌术后快速复发相关的分子机制仍知之甚少。深入探索HCC复发相关机制，可以提高我们对肿瘤发生发证相关机制的理解，有助于发现更有效的HCC治疗策略，包括免疫疗法，从而进一步提高肝癌病人总体生存率的关键课题。
近期，复旦大学的樊嘉及其合作团队利用12例原发性HCC患者和6列早期复发HCC病例的个细胞转录组分析，首次深度刻画这两个不同期肝癌肿瘤免疫微环境。
1.原发性和复发性HCC肿瘤免疫微生态的ScRNA-seq分析
为了解早期复发HCC肿瘤生态系统，收集12例未经治疗的原发性HCC患者和6例早期复发性HCC患者的外科手术肿瘤样本和配对的癌旁组织，用细胞分选（FACS）分离CD45+和CD45-细胞，然后对通过质控的16,个细胞进行单细胞测序（scRNA-seq）。另外招募4名患者（包括配对的原发性样本PT和早期复发性样本RT）为验证队列1，同时来自另外的47名患者的配对的PT和早期RT样本用于免疫组化（IHC）和批量RNA测序验证，为验证队列2（图1）
采用Seurat进行细胞分类和标记基因鉴定来构建一个全面的肿瘤生态位谱并发现了24个聚类群。非免疫细胞主要由内皮细胞、肝星状细胞、正常上皮细胞及HCC肿瘤细胞。大部分患者的ECs和HSCs比列比较低，不超过非免疫细胞的5%。大部分非免疫细胞是表达肝细胞样基因的肿瘤细胞。
肿瘤微生态中的免疫细胞包括髓源性细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞。所有这些细胞亚型均不同比例存在患者及PT和RT样本中另外一些免疫细胞类群在不同的患者中比例不同，提示着HCC肿瘤免疫细胞成分的异质性（图1）。
图1原发性和复发HCC肿瘤环境的ScRNA-seq分析
2.早期复发性HCC具有独特的免疫微生态系统
接下来作者用无监督聚类分析髓源性细胞和T细胞/NKs。分析发现，与原发性HCC患者比较，复发性HCC患者呈现一个独特的免疫微生态系统，表现为DC细胞比例升高、Tregs细胞减少、T细胞增殖减少及CD8+T细胞丰度更高，这些发现也被验证队列1的scRNA-seq以及验证队列2的IHC结果所进一步证实。（图2D-F、3C、3F、3E）
图2原发性和复发性HCC肿瘤中髓源性细胞组成
图3原发性和复发性HCC肿瘤中T/NK细胞亚型
3.CD8+T细胞在原发性和早期复发HCC患者中具有相同的转换轨迹但状态不同
接下来采用Monocle分析HCC浸润CD8+T细胞的动态免疫状态和细胞转换轨迹。分析发现，PT和RT样本中CD8+T细胞的转换轨迹相同，但细胞呈现不同的免疫和转录状态，提示着原发性和复发性HCC应考虑不同的免疫治疗策略。（图4）
图4RT和PT样本中CD8+T细胞转换轨迹分析
4.早期复发HCC中CD8+T细胞呈先天样表型
对RT样本中CD8+T细胞的独特转录状态进行进一步的分析发现，与PT样本中的衰竭状态不同，RT样本CD8+T细胞中KLRB1过表达，呈现为先天性功能失调状态，且细胞毒性和免疫抑制表型较低（图5）。同时，KLRB1highCD8+T细胞相关基因表达信号的富集与复发性和原发性HCC的不良预后和肿瘤进展息息相关。
图5早期复发HCC中CD8+T细胞以先天的样表型存在
6.早期复发性HCC中CD8+T细胞表现较低的克隆性扩增
接下来，作者测定CD8+T细胞的克隆性扩增能力。RT样本中CD8+T细胞几乎没有表现出克隆性扩增，CD8+T细胞的非活化表型可能是由于在复发肿瘤细胞中丢失了匹配的新抗原，提示着由于肿瘤的选择（部分原因CD8+T细胞克隆在RT中处于低增殖和无反应状态，这些细胞不能识别和消除带有亚克隆新抗原的复发肿瘤细胞。（图6）
图6早期复发性HCC中CD8+T细胞表现较低的克隆性扩增
7.恶性细胞导致早期复发性HCC独特的微环境
前面数据分析发现，复发性HCC中Tregs细胞减少、巨噬细胞及其他免疫抑制型T细胞亚型均无增加，这提示着PT和RT间持续的肿瘤微环境差异来自恶性细胞。RT中的恶性细胞表现出免疫逃逸能力的增强和细胞增殖能力的减少。复发性HCC中恶性细胞可以通过PD-L1-CD80/CTLA4-CD80轴破坏DC细胞的抗原呈递，并通过CCL20-CCR6轴招募先天性CD+CD8+T细胞，从而在早期复发性HCC中形成功能失调的抗肿瘤活性。（图7）
图7恶性细胞导致早期复发性HCC独特的微环境
该研究运用单细胞全转录组测序技术，对肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统做出了系统性的刻画，在单细胞水平揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制。
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撰写：方方
编辑：商均
审稿：DHL
图片来源于网络，版权归原作者所有。如有异议，请联系本
真是万万没想到！巨噬细胞竟然把抗癌药吃了，难怪有那么多患者对PD-1/L1抗体不响应。如果不是哈佛大学医院的MikaelJ.Pittet教授团队亲眼看到，任谁也不会想到，作为人体安全卫士的巨噬细胞，竟然会把好不容易结合到T细胞上的抗癌药物PD-1抗体吞噬掉。
今天，Pittet教授团队的这一重要研究成果以封面的形式刊登在《科学转化医学》上（1）。文章的第一作者是SeanP.Arlauckas和ChristopherS.Garris。
科学转化医学的封面
目前最有希望的抗癌方案就是通过免疫检查点抑制剂增强机体免疫系统对抗肿瘤。然而目前FDA批准的所有的免疫检查点抑制剂都不是对所有患者有效（2），研究人员对于免疫检查点的耐药机制还没有完全的了解。然而医院Pittet教授的团队想知道，PD-1抗体进入人体之后究竟发生了什么，是什么在阻挡它起作用。
他们了解背后机制的方法很特殊，直接看。对，就是看！
这就要感谢活体显微镜技术的出现。为了在显微镜下看到药物起作用的整个过程，Pittet教授团队给PD-1抗体加了个*色标记。然后利用活体显微镜来实时监测标记后的PD-1抗体在结肠癌小鼠模型中的动向。
老鼠活体成像前对相关细胞的标记
他们发现在结肠癌模型小鼠体内注射标记的PD-1抗体5分钟后，就在肿瘤微环境内的T细胞上发现了染色标记。这是最早在肿瘤组织中检测到被标记的细胞。研究人员观察到，最开始标记的PD-1抗体结合到肿瘤浸润T细胞周围而几分钟后在T细胞表明形成色块，之后，这些色块被发现都在肿瘤相关巨噬细胞内。
这些原本用来激活T细胞的PD-1抗体怎么都跑到巨噬细胞里面去了？被巨噬细胞吃了？
为了深入了解巨噬细胞是如何吃掉PD-1抗体的。研究人员首先提取了三种肿瘤模型中小鼠体内相关细胞发现，大部分的肿瘤相关巨噬细胞内都有PD-1抗体。随后的数据线性回归分析发现，巨噬细胞吃掉抗体与巨噬细胞的数量无关，即使巨噬细胞的数量极低，PD-1也能被吃光，而且巨噬细胞不会主动与PD-1抗体结合。
人体巨噬细胞（红色）吞噬T细胞（海蓝色）表面的PD-1抗体（*色）
研究人员随后在体外创建了一个由骨髓分离得到的巨噬细胞，T细胞共培养体系来研究巨噬细胞是如何吃掉抗体的。首先将T细胞与标记后的PD-1抗体共培养，然后与巨噬细胞共培养，在实验中发现，标记后的PD-1抗体在数分钟之内就从T细胞上转移至巨噬细胞中。这不能仅仅归结为巨噬细胞的吞噬作用，因为研究人员加入了吞噬抑制剂后，这一转移仍旧很快发生。并且巨噬细胞不会吞噬没有与T细胞结合的标记的PD-1受体。
既然肿瘤相关巨噬细胞并不与PD-1抗体结合，也不会在标记的PD-1抗体注射的早期吃掉PD-1抗体。因此研究人员推测，PD-1抗体的转移是通过一种非抗原特异性机制。随后研究人员发现巨噬细胞表面存在Fcγ受体，这一受体与T细胞PD-1抗体复合物上Fc结构域相结合，介导PD-1抗体的吞噬。
随后研究人员利用以流式细胞计监测的抗体转移实验证明了这一发现。T细胞首先与染色后的PD-1抗体共培养30分钟，后与巨噬细胞一起培养，最后用流式细胞计分析，大量PD-1抗体在巨噬细胞内被测出。然而，在实验开始时加入Fcγ受体抑制剂那么PD-1抗体就不会从T细胞转移到巨噬细胞。之后研究人员利用酶偶联免疫吸收剂实验发现，巨噬细胞与T细胞以及与鼠PD-1抗体同源的IgG2a抗体共培养，同样IgG2a抗体被巨噬细胞降解。
表面吸附PD-1抗体的T细胞加上Fcγ受体抑制剂后不会被巨噬细胞吞噬反之aPD-1抗体会被吞噬
由于Fc/FcγR与抗体的结合与抗体的Fc结构域上的多糖结构相关，研究人员分析了老鼠的PD-1抗体以及人类PD-1抗体，结果发现老鼠和人类PD-1抗体上主要糖的类型是相同的。从而研究人员怀疑老鼠体内Fcγ受体介导的抗体转移，人体也会发生相关的抗体转移。
随后研究人员在体外将人PD-1抗体nivolumab用AF标记并在体外共培养系统中与免疫T细胞共培养，之后从人体血液单核细胞中分离出巨噬细胞，再将二者用共培养3天，同样导致PD-1抗体转移到巨噬细胞，同样转移可以被Fcγ受体抑制剂抑制。证明Fcγ受体同样调节nivolumab在人体的摄取。
nivolumab
同时研究人员也找到了防止PD-1抗体被吞噬的方法。研究人员利用一种酶PNGaseF来除去老鼠PD-1抗体上的糖链，然后用AF标记，发现除去糖之后的PD-1仍能与T细胞结合，并且不会被巨噬细胞吃掉。之后研究人员在小鼠体内验证了当Fcγ受体被抑制后，PD-1抗体的活性，发现当Fcγ受体被抑制后显著延长PD-1抗体与T细胞结合的时间，并且Fcγ受体被阻断的结肠癌模型小鼠中所有小鼠对PD-1抗体产生响应，所有小鼠的肿瘤都被完全抑制（3）。
目前PD-1抗体单独使用的响应率仅30%左右（4）。而小鼠体内，PD-1抗体加Fcγ受体阻断剂却对所有老鼠产生响应。这一发现无疑对目前免疫治疗领域造成巨大影响，为免疫治疗不敏感癌症患者提供新的治疗方案，让癌症变得不再可怕。
参考资料：
1.