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原发性肝癌（简称“肝癌”）是最常见的恶性肿瘤之一，是全球癌症相关死亡的第四大原因。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要形式，占患者的75%-85%。目前，手术切除肝癌治疗的首选方式，但术后5年内仍有60%-70%患者出现转移和复发，且术后2年早期复发占复发HCC病例的70%。这种复发几乎无治疗手段，严重影响影响患者长期生存。目前，我们对于与肝癌术后快速复发相关的分子机制仍知之甚少。深入探索HCC复发相关机制，可以提高我们对肿瘤发生发证相关机制的理解，有助于发现更有效的HCC治疗策略，包括免疫疗法，从而进一步提高肝癌病人总体生存率的关键课题。
近期，复旦大学的樊嘉及其合作团队利用12例原发性HCC患者和6列早期复发HCC病例的个细胞转录组分析，首次深度刻画这两个不同期肝癌肿瘤免疫微环境。
1.原发性和复发性HCC肿瘤免疫微生态的ScRNA-seq分析
为了解早期复发HCC肿瘤生态系统，收集12例未经治疗的原发性HCC患者和6例早期复发性HCC患者的外科手术肿瘤样本和配对的癌旁组织，用细胞分选（FACS）分离CD45+和CD45-细胞，然后对通过质控的16,个细胞进行单细胞测序（scRNA-seq）。另外招募4名患者（包括配对的原发性样本PT和早期复发性样本RT）为验证队列1，同时来自另外的47名患者的配对的PT和早期RT样本用于免疫组化（IHC）和批量RNA测序验证，为验证队列2（图1）
采用Seurat进行细胞分类和标记基因鉴定来构建一个全面的肿瘤生态位谱并发现了24个聚类群。非免疫细胞主要由内皮细胞、肝星状细胞、正常上皮细胞及HCC肿瘤细胞。大部分患者的ECs和HSCs比列比较低，不超过非免疫细胞的5%。大部分非免疫细胞是表达肝细胞样基因的肿瘤细胞。
肿瘤微生态中的免疫细胞包括髓源性细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞。所有这些细胞亚型均不同比例存在患者及PT和RT样本中另外一些免疫细胞类群在不同的患者中比例不同，提示着HCC肿瘤免疫细胞成分的异质性（图1）。
图1原发性和复发HCC肿瘤环境的ScRNA-seq分析
2.早期复发性HCC具有独特的免疫微生态系统
接下来作者用无监督聚类分析髓源性细胞和T细胞/NKs。分析发现，与原发性HCC患者比较，复发性HCC患者呈现一个独特的免疫微生态系统，表现为DC细胞比例升高、Tregs细胞减少、T细胞增殖减少及CD8+T细胞丰度更高，这些发现也被验证队列1的scRNA-seq以及验证队列2的IHC结果所进一步证实。（图2D-F、3C、3F、3E）
图2原发性和复发性HCC肿瘤中髓源性细胞组成
图3原发性和复发性HCC肿瘤中T/NK细胞亚型
3.CD8+T细胞在原发性和早期复发HCC患者中具有相同的转换轨迹但状态不同
接下来采用Monocle分析HCC浸润CD8+T细胞的动态免疫状态和细胞转换轨迹。分析发现，PT和RT样本中CD8+T细胞的转换轨迹相同，但细胞呈现不同的免疫和转录状态，提示着原发性和复发性HCC应考虑不同的免疫治疗策略。（图4）
图4RT和PT样本中CD8+T细胞转换轨迹分析
4.早期复发HCC中CD8+T细胞呈先天样表型
对RT样本中CD8+T细胞的独特转录状态进行进一步的分析发现，与PT样本中的衰竭状态不同，RT样本CD8+T细胞中KLRB1过表达，呈现为先天性功能失调状态，且细胞毒性和免疫抑制表型较低（图5）。同时，KLRB1highCD8+T细胞相关基因表达信号的富集与复发性和原发性HCC的不良预后和肿瘤进展息息相关。
图5早期复发HCC中CD8+T细胞以先天的样表型存在
6.早期复发性HCC中CD8+T细胞表现较低的克隆性扩增
接下来，作者测定CD8+T细胞的克隆性扩增能力。RT样本中CD8+T细胞几乎没有表现出克隆性扩增，CD8+T细胞的非活化表型可能是由于在复发肿瘤细胞中丢失了匹配的新抗原，提示着由于肿瘤的选择（部分原因CD8+T细胞克隆在RT中处于低增殖和无反应状态，这些细胞不能识别和消除带有亚克隆新抗原的复发肿瘤细胞。（图6）
图6早期复发性HCC中CD8+T细胞表现较低的克隆性扩增
7.恶性细胞导致早期复发性HCC独特的微环境
前面数据分析发现，复发性HCC中Tregs细胞减少、巨噬细胞及其他免疫抑制型T细胞亚型均无增加，这提示着PT和RT间持续的肿瘤微环境差异来自恶性细胞。RT中的恶性细胞表现出免疫逃逸能力的增强和细胞增殖能力的减少。复发性HCC中恶性细胞可以通过PD-L1-CD80/CTLA4-CD80轴破坏DC细胞的抗原呈递，并通过CCL20-CCR6轴招募先天性CD+CD8+T细胞，从而在早期复发性HCC中形成功能失调的抗肿瘤活性。（图7）
图7恶性细胞导致早期复发性HCC独特的微环境
该研究运用单细胞全转录组测序技术，对肝癌原发肿瘤和早期复发肿瘤的免疫微生态系统做出了系统性的刻画，在单细胞水平揭示了早期复发肝癌特征性免疫图谱和免疫逃逸机制。
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撰写：方方
编辑：商均
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