肿瘤的精准治疗需要通过判定肿瘤的分子生物学特征来寻找最合适的治疗方法，目前其研究热点正日益转向液体活检。液体活检可以分析患者体液中的肿瘤成分（包括循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA），这些体液主要是指血液，但也包括其他容易获得的体液，如尿液、腹水或胸腔积液。由于这些检查是相对无创的，并可在多个时间点重复，因此有利于监测疾病进程。年《NatureReviews》杂志发表了题为《Currentandfutureperspectivesofliquidbiopsiesingenomics-drivenoncology》的综述，总结了已批准用于临床的液体活检应用的例子；讨论了当前用于ctDNA的分析和临床有效性的证据；反思如何应对应用液体活检的存在挑战，现介绍如下。
液体活检在临床的应用
临床中采用肿瘤生物标志物测试的三个主要条件为：分析效度（评估测试的准确性、可靠性和重复性）；临床效度（评估测试划分流行人群的能力，将临床结果显著不同的患者分成不同的组）；临床实用性（用于评估接受测试的患者与未接受测试的患者相比是否改善了结果）。然而，肿瘤生物标志物的测试是复杂的，甚至美国FDA批准的生物标志物测试也不一定必须建立临床实用性。此外，许多商业上可获得的肿瘤生物标志物测试从未提交FDA审查，而是作为实验室开发的测试（LDT）进行销售。
细胞搜索系统（MenariniSiliconBiosys-tems）是FDA批准的用于转移性乳腺癌、前列腺癌或结直肠癌患者的循环肿瘤细胞（CTC）检测器。在转移性乳腺癌或前列腺癌患者中，每7.5ml血液中含有≥5个CTCs是降低无进展生存率（PFS）的强预测因子，而每7.5ml血液中含有5个CTCs是改善总生存率（OS）的预测因子。对于转移性肠癌，PFS的预测阈值为≥3CTC/7.5ml，OS的预测阈值为3CTC/7.5ml。CTC定量对转移性乳腺癌、前列腺癌或结肠癌患者以及用新辅助化疗治疗的非转移性乳腺癌患者的预后的分析和临床有效性已经在涉及数千患者的研究和/或汇总荟萃分析中得到验证。然而CTC计数尚未广泛应用于这些实体肿瘤的检测，主要是因为它尚未被证明具有临床实用性。
相比之下，FDA批准的两种基于cfDNA（细胞游离DNA）的检测也已被证明其临床实用性，即检测肺癌患者血浆cfDNAEGFR突变的cobasEGFR突变试验v2（Roche分子诊断）和检测结直肠癌筛查的患者血浆cfDNA中SEPT9启动子的甲基化状态的EpiproColon（表观基因组学AG）。
循环肿瘤DNA（ctDNA）作为肿瘤标志物的评价
2.1ctDNA作为生物标志物在精准肿瘤学中的潜力。
ctDNA可能来源于凋亡细胞，可能代表肿瘤细胞的特定亚型。此外，它反映了从多个肿瘤区域或不同肿瘤灶释放的DNA，提供了肿瘤基因组的全面视图。ctDNA的研究中已经检测到在相应的组织样本中遗漏的体细胞突变。与CTC相比，ctDNA的一个明显优势是可以反映疾病的程度，从而反映其对特定治疗的反应程度。非小细胞肺癌（NSCLC）和高度浆液性卵巢癌（HGSOC）中肿瘤体积与ctDNA血浆变异等位基因频率（VAF）呈线性关系，另一项研究发现肺癌患者治疗前ctDNA浓度与肿瘤体积高度相关。此外，ctDNA已被证明是与结肠癌、卵巢癌和肺癌患者复发和不良预后相关的强有力的标志物。最后，ctDNA分析能够检测耐药性，如接受抗EGFR治疗的结直肠癌患者的KRAS突变；在用各种疗法治疗的乳腺癌患者中增加PIK3CA、MED1或EGFR等基因的变异等位基因频率。总之，ctDNA的这些特征使它成为肿瘤精准治疗中极有前景的分析物之一。然而，ctDNA也有一些实质性的限制，例如其血浆浓度通常较低，以及因细胞衰老和验证问题带来的混杂因素。
2.2血浆中ctDNA含量低。
ctDNA水平在患者之间可能存在很大差异，即使是那些患有相同肿瘤类型的患者。在转移性疾病中，有相当一部分患者血浆中含有极低比例的ctDNA。平均而言，来自肿瘤患者的1ml血浆含有大约个二倍体基因组当量（GE）（~10ngDNA）（Fig2a），在转移性肿瘤患者中经常观察到相当高的量。通常10ml血平均产生4ml血浆，含GE，这意味着理论上灵敏度极限为~0.01％（即，在份拷贝中检测1个片段的能力）。如果ctDNA的VAF为0.1％，则平均每管只有6个分子携带相应的突变，这可能受到随机抽样的影响（Fig2b）。因此，这些影响因素对突变的可靠、准确和可重复的检测构成了相当大的挑战。
2.3血浆中低水平ctDNA的检测方法
可检测分子的数量可以通过显著增加样本体积（即，抽取更多的血液）而增加，但是这种方法在临床晚期肿瘤患者中通常不可行。或者，通过同时检测大量突变并确定将血浆样品分类为肿瘤阳性所需的检测到突变的最小数目，可以补偿输入分子的数量低(Fig2c)。
ctDNA技术最新的发展集中于提高测序方法的分析灵敏度，这可能受到在DNA制备期间或测序本身引入的错误以及所选测序方法的准确性和覆盖率的影响。通过使用分子条形码可以减轻由这些因素引起的误差的影响并提高灵敏度。其他增加敏感性的尝试集中在根据ctDNA片段的长度来富集ctDNA。最近的一项研究报告指出，可以通过从聚丙烯酰胺凝胶电泳的血浆DNA中切除适当大小的DNA条带来富集ctDNA。此外，在结直肠癌或乳腺癌和高ctDNA浓度的患者中，长度大于bp的双核体DNA片段的频率增加。如果类似的机制在肿瘤细胞中起作用，那么DNA片段长度的测量可能具有区分促进DNA循环的各种细胞源的潜力。
2.4细胞衰老带来的限制。
尽管有这些检测低VAF突变的改进方法，但衰老细胞生物学对ctDNA作为生物标志物的应用仍存在若干限制。一个重要的混淆因素是良性体细胞异质性，即细胞衰老过程中体细胞突变在非肿瘤性病变中的积累。如果在癌症驱动基因中发生突变，则可以赋予干细胞以适应性优势，并使其经历克隆扩增，这可以在ctDNA中检测到，并错误地归因于肿瘤发生。在非肿瘤组织中发现了与肿瘤中观察到的突变非常相似的TP53突变，这些突变有可能在来自非肿瘤个体的血浆cfDNA中。因此，检测ctDNA中癌症驱动基因的突变不能等同于肿瘤形成的证据。
2.5预分析，分析和临床验证。
商用ctDNA检测的一致性和临床有效性仍不能确定。最近由美国临床肿瘤学协会和美国病理学家协会联合审查发现，在晚期肿瘤中，大多数ctDNA检测的临床有效性和实用性的证据不足。目前缺乏多中心研究，足够大的患者数，以建立ctDNA的分析和临床效度。此外，还需要标准的操作程序和指导方针。在液体活检技术能够常规地用于临床实践之前，需要通过已建立的标准进行全面验证、循环试验和外部质量评估。
新出现的液体活检分析物
尽管目前基于液体活检的检测不能满足精准肿瘤学的需要，但扩大从ctDNA和CTC中提取的信息的范围和所检测的分析物的范围可能有助于实现它们的全部潜力。实施多源信息组合的新型多参数策略将在临床建立液体活检中起关键作用。
3.1组织和肿瘤特异性DNA甲基化模式
CpG位点甲基化是基因表达和组织分化的重要表观遗传调控因子。甲基化模式可用于绘制cfDNA来源的组织图或直接检测肿瘤。有研究表明在临床诊断乳腺癌和卵巢癌两年之前，外周血中已经可以检测到一些肿瘤特异性甲基化改变。目前cfDNA是最广泛接受甲基化分析的液体活检分析物。
3.2核小体定位图
由于cfDNA优先从凋亡细胞中释放，它以受核小体保护的，主要是单核小体的DNA形式循环，因此，cfDNA的深度测序可以分析核小体定位的峰峰间隔从而生成核小体定位图。与甲基化变化相似，核小体的位置因细胞类型而异，可用于追踪来源的cfDNA组织。
3.3定义miRNA特征
循环RNA已经通过各种方法进行研究，如RNA测序（RNA-seq）、定量PCR（qPCR）和微阵列。miRNA尤其受到