癌症生物学的一个核心是癌基因如何驱动分子信号网络的重新布线来执行表型改变。对分子网络进行解码的最初尝试是通过基于抗体的蛋白质组学方法。然而由于抗体的可获得性和特异性，这些靶向方法受到了广度和深度的限制。
最近基于质谱（MS）的蛋白质组学技术已成为对全基因组蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行无偏分析的主流策略。这些方法与先进的DNA测序一起为深度组学分析提供了前所未有的机会。现在可以整合转录组，深层蛋白质组和磷酸化蛋白质组来剖析致癌信号网络，从而拓宽了实验对癌症生物学的认识。
在儿童和成人HGG中，血小板源性生长因子受体α(PDGFRA)和神经营养酪氨酸受体激酶(NTRK)融合基因的突变和/或扩增经常被发现。
为了生成深层的小鼠HGG蛋白质组和磷酸化蛋白质组景观，使用了实验新开发的具有广泛的肽分离能力和高质量分辨率的MS管线。
小鼠HGG样品是通过颅内植入经PDGFRADV突变或TPM3-NTRK1融合转导的无p53的原代星形胶质细胞生成的，这是人类HGGs中发现了两个致癌致癌受体酪氨酸激酶(RTK)。两种模型均产生具有高度有丝分裂多形性肿瘤细胞的HGG，其中许多具有星形细胞分化特征。HGGs以局灶性肿块的形式生长，在肿瘤边界处有明显的浸润区域进入周围的实质
将HGG和正常小鼠皮质样品进行蛋白质组，磷酸化蛋白质组和转录组分析。串联质量标签（TMT）标记用于对十个样品进行大规模平行蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量。应用广泛的碱性pH反相液相色谱（LC）分离，然后进行超长酸性pH反相LC分离，以促进最大程度的肽分离。结果，鉴定出13,个蛋白质（11,个基因产物，,个肽和3,,个MS2扫描）和30,个磷酸位（个磷蛋白，45,个磷肽，1,,个MS2扫描）。
检查两个转导的人类致癌基因的质谱结果，并与先前研究中报道的Westernblot检测的磷酸化事件进行了比较，并对所有测量结果进行了分类。结果是外源人类PDGFRADV和TPM3-NTRK1的蛋白表达水平与HGG基因型一致。
主成分分析和层次聚类分析表明，两种RTK癌基因驱动不同的蛋白质组，磷酸化蛋白质组和转录组谱。此外，在小鼠HGG中表达的突变PDGFRA或NTRK融合基因的表达水平与在具有这些突变的人肿瘤细胞中发现的表达水平相关。分析了蛋白质组和转录组的相关性和分析深度。转录本水平和蛋白质丰度显示出中等相关性，与先前报道的数据集一致。
首先在小鼠皮质，PDGFR和NTRKHGGs中鉴定了差异表达的蛋白质，并通过WGCNA30和ClueGO软件包31进行了基因共表达聚类，通路分析和功能模块分类。共鉴定了个差异表达蛋白和个差异表达磷酸位点，并分别分布在五个完整蛋白质组共表达簇（WP-C）和五个磷酸蛋白质组共表达簇（PP-C）中，形成67个功能模块。
与正常皮层相比，在肿瘤中重新连接的两个最大模块是与肿瘤细胞增殖相关的细胞周期，以及PI3K信号级联，其转导RTK下游的信号。总的来说，在HGG肿瘤中重新连接了包括癌症信号传导，基因表达，细胞粘附，代谢和神经元功能在内的一系列模块组。
三个簇（WP-C1，PP-C1和PP-C2）显示出相似的变化模式：皮质PDGFRAHGGNTRKHGG，并且大多数已知的神经胶质瘤途径都富含这三个簇，表明NTRKHGG激活了类似的致癌途径，但在全局途径水平上的反应幅度大于PDGFRAHGG。
此外，大多数HGG癌症信号传导途径仅在磷酸化蛋白质组中发生改变，而在整个蛋白质组中则未发生改变，这突显了磷酸化蛋白质组学分析对致癌信号传导的不可或缺的作用。因此，这些结果表明，RTK致癌基因在HGG小鼠的磷酸化和/或蛋白表达水平上驱动信号网络的大规模重排。
可以使用计算机程序通过底物磷酸化水平推断蛋白激酶的活性，因此使用了机器学习算法IKAP来评估种激酶的活性，层次聚类分析将这些激酶活性分为多个主要簇，类似于图3c中的皮质，PDGFRA和NTRKHGG之间的三个主要差异调节模式（即PP-C1，PP-C2，PP-C5）。
检查PhosphoSitePlus数据库中报道的激酶与底物的关系，这些激酶在激酶与激酶的信号转导网络中进一步相连。
在HGGs中鉴定了胶质瘤发生中的多种已知激酶，包括AKT，PKC，MAP激酶级联和SRC家族激酶。其他调节关键细胞内系统的激酶也进行了重新布线，包括AMPK（PRKAA1，PRKAA2）和p21激活的激酶（PAK1，PAK3）。其中AMPK是一种代谢主传感器，可调节葡萄糖转运蛋白GLUT4的产生，脂肪酸β-氧化和线粒体的生物发生。PAK调节细胞骨架重组和细胞运动。
与正常皮质相比，HGGs还显示出更高水平的CDK5，CAMK2A和CAMK2D。尽管这些激酶是神经元功能和突触可塑性的特征明确的调节剂，但它们也存在于胶质母细胞瘤中，在胶质母细胞瘤中起迁移，侵袭，线粒体调控和钙信号传导作用。
进一步总结了这些激酶在激酶超家族水平上的活性。而AGC（环状核苷酸依赖性家族，蛋白激酶C家族，核糖体S6家族及相关激酶），CMGC（细胞周期蛋白依赖性激酶，促分裂原活化蛋白激酶，糖原合酶激酶和cdk样激酶）和CAMK（主要是激酶调节型）通过钙/钙调蛋白）在HGG肿瘤中显着开启超家族激酶，NTRKHGG在AGC和CMGC超家族中显示出比PDGFRAHGG更高的活性，支持更强的细胞增殖信号和细胞周期重新连接。
考虑到AKT是RTK激活后PI3K-AKT信号级联的中心节点，进一步分析了AKT底物上激酶激活的输出。34个AKT底物显示出与AKT活性一致的磷酸化模式。活性最高的AKT底物是细胞周期和增殖调节剂（CHEK1S和BRCA1S），中央葡萄糖代谢调节剂（例如AMPKA1S和AST）以及迁移和血管生成调节剂（例如eNOSS，VIMS39和FLNCS）。对于其他激酶-底物连接（AMPKA1，CDK5，MAPK3，ATR，ATM，PAK1和FYN）的整合，也获得了相似的结果。
总而言之，全面的激酶活性分析能够在两个HGG肿瘤模型中鉴定主激酶和激酶激活的下游结果，在这些模型中，PI3K途径激活是由人类HGG中发现的不同受体酪氨酸激酶突变驱动的。
通过系统生物学方法，通过多个步骤对小鼠HGG中的转录组，蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行了综合分析，从而探索了TF的活性。转录组中的靶基因表达共有47种TF活性，其中38种TF通过MS鉴定。其他完整的蛋白质组和/或磷酸化蛋白质组数据支持激活38个TF中的23个。
基于报道的活化位点的磷酸化增加，五个TF显示出活性状态。活化程度最高的TF中，是一般TF的TFII家族（GTF2B，GTF2F1，TAF1，TAF7和TBP），它们组装了RNA聚合酶II预起始复合物并控制总体转录速率。转录抑制因子REST（大脑中的染色质修饰剂），REST靶基因的表达在肿瘤中较低，而在正常皮层中较高，暗示REST可能通过抑制靶基因表达而在HGG肿瘤转化中发挥作用。因此，这种综合分析揭示了TF激活剂和抑制剂的激活，这导致肿瘤细胞转录组和蛋白质组的明显重编程。
通过在PhosphoSitePlus数据库和ENCODE数据库中将已知的激酶与激酶和TF结合到靶基因连接上，在HGG中构建了以激酶-TF为中心的网络，并在数据集中实现了一致的共激活模式，从而简化了以激酶-TF为中心的网络由五个激酶（AKT1，MAPK3，CDK5，PRKCA和AMPK）和六个TF（c-MYC，JUND，JUN，EP，BRCA1和CEBPB）组成。c-MYC家族（MYC，MAX）和AP-1家族（JUN，JUND）调节肿瘤发生过程中的多种中心生物学过程。实际上有多个c-MYC靶标具有转录活性，强烈支持c-MYC在HGG肿瘤中的核心作用。
对主要TF的仔细检查发现HGG中主要的转录激活下游生物过程。最活跃的生物学过程与增殖相关，包括核糖体的生物发生，翻译和RNA加工（c-MYC，BRCA1和CEBPB的靶标），能量代谢（包括线粒体和代谢）（c-MYC，JUN和EP的靶标）以及细胞迁移，包括细胞外基质和粘着斑（JUN和EP的靶标）。在激酶-TF网络中，c-MYC，JUN和EP通过主能量和增殖传感器激酶（AMPK和MAPK）的磷酸化被激活。值得注意的是，据报道，由这三个TF激活的多种代谢酶在增殖和能量压力期间至关重要，例如腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）调节核苷酸的挽救途径以从头合成嘌呤，鸟氨酸脱羧酶（ODC1）用于多胺生物合成。响应生长刺激。总而言之，实验的系统生物学方法利用多层信息来优先处理中心HGGTF，激酶及其在HGG肿瘤中的相互作用。
跨物种的组学整合可能是鉴定人类癌症中致癌事件的有效方法。因此，实验还将小鼠HGG中变化最明显的组学数据集映射回人类转录组数据，以搜索跨物种的NTRK和PDGFRA突变驱动的一致变化，从而得出20种小鼠和人类趋同性变化的列表。这些基因中的大多数在癌症相关过程中起作用，包括对癌细胞干性，血管生成，肿瘤微环境和侵袭的调节，共同凸显了种间分析的潜力，可从大规模多组学中优先选择与癌症相关的候选物数据集。
生物信息学分析表明，NTRKHGG中的全球癌症网络重布线比PDGFRAHGG更强，表明NTRK的致癌效力高于PDGFRA突变。
为了评估RTK癌症驱动基因的致癌潜能，实验修改了最初设计用于基因表达分析的PAC算法，以计算PI3K-AKT信号总活性。蛋白质活性源自具有已知功能的磷酸位，其可以促进或抑制肿瘤发生。
在这两个HGG中，PI3K-AKT途径均明显活跃，并调用了类似的下游途径，例如蛋白质合成（S6、4EBP1和EIF4B），细胞周期进程（RB1，MYC和RB12），细胞增殖和血管生成（BRCA1，eNOS，ERK）。比较这些蛋白质在NTRK和PDGFRAHGG之间存在统计学差异的27个调节性磷酸位点时，大多数显示NTRKHGG中的改变高于PDGFRAHGG。这表明TPM3-NTRK1融合基因具有比PDGFRADV更强的致癌能力。
通过实验验证实验预测的TPM3-NTRK1和PDGFRADV的致癌潜能，实验分析了两只HGG小鼠的细胞增殖指数和Kaplan-Meier生存曲线。增殖指数由表达增殖标志物Ki67的肿瘤细胞的比例定义,NTRKHGG小鼠的潜伏期比PDGFRA小鼠短得多。
为了检查是否需要通过多组学方法优先确定的主调节子才能维持肿瘤生存，实验首先建立了从NTRK驱动的HGG小鼠肿瘤组织中收集的HGG原代细胞的体外培养物，然后设计了一个汇集的mini-gRNA文库以靶向这些主子。
实验使用了TransEDIT-dualCRISPR-Cas9系统，其中重组慢病毒表达通过机器学习方法设计的双gRNA，以促进基因的功能切除。
在CRISPR-Cas9筛选过程中，实验靶向了两种类型的主调控因子（激酶和TF），包括从转录组和蛋白质组数据中提取的9个基因，并且还针对了通过与小鼠和人类进行跨物种比较而鉴定出的6个基因肿瘤，每个都有六个不同的gRNA。进行辍学分析以鉴定负责肿瘤存活的必要调节剂。如果选择15天后三个双gRNA计数中有两个与起始人群相比显着减少，则认为靶向基因对肿瘤生存力很重要。在该截止值下，没有阴性对照gRNA被富集。另一方面，已显示56％优先的主调节剂对HGG肿瘤的生长至关重要。
发现调节细胞代谢的所有三种激酶（即PRKAA1，PRKAA2和EEF2K）都有助于HGG细胞的活力，从而提供了一种新型的肿瘤易感性。在筛选过程中，两个TF（Jun和Myc）被证明是阳性。鉴于RTK-PI3K-AKT诱导了广泛的下游变化，因此指出Jun和Myc可以得出有关RTK融合如何诱导HGG肿瘤发生的有价值的见解。因此，此CRISPR-Cas9筛选揭示了能量代谢的新型肿瘤脆弱性，以及Jun和Myc参与NTRK融合诱导的肿瘤发生，共同证实了多组学整合方法发现主调节剂的有效性。
Reference:Deepmultiomicsprofilingofbraintumorsidentifiessignalingnetworksdownstreamofcancerdrivergenes.PMID：预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇