对于有淋巴结病和/或脾肿大，伴DNT升高的患者应警惕ALPS的可能，遗传学和生物标志物检查可以明确诊断。
摘要自身免疫性淋巴细胞增生综合征（autoimmunelymphoproliferativesyndrome,ALPS）是由于影响外源性凋亡通路的基因（FAS、FASL、CASP10）突变引起的一种罕见的免疫缺陷。本研究调查了例可能患有ALPS患者的临床表现、实验室检查和分子遗传学检查结果。采用荧光激活细胞分选法评估双阴性T细胞（double-negativeT-cell,DNT）百分比和体外凋亡功能；用酶联免疫吸附试验测定白介素-10（interleukin10,IL-10）、IL-18和可溶性FAS配体（solubleFASligand,sFASL）水平；采用二代测序技术进行基因学分析。从患者病历中获取患者的临床数据。将纳入患者分为确诊ALPS、疑似ALPS和非疑似ALPS三组，并对各组间的实验参数进行对比。例患者中有38例患者符合ALPS确诊标准，17例符合疑似ALPS标准。确诊APLS组和疑似ALPS组患者的DNT百分比和淋巴细胞增生率均高于非疑似ALPS患者。确诊ALPS患者与疑似ALPS患者（P=0.）和非疑似ALPS患者（P0.）相比，体外凋亡功能异常更加显著，并且膜联蛋白水平低。DNTs升高和体外凋亡功能异常这两个检测结果对于识别所有类型的ALPS患者是最有用的标准；而体外凋亡功能异常与sFASLs升高这两个检测结果则是识别ALPS-FAS群体的最佳预测指标。淋巴细胞增生、体外凋亡功能试验和DNTs是ALPS最敏感的诊断学标志物；此外，IL-10和IL-18水平升高也是ALPS的诊断指标。sFASLs升高与体外凋亡功能试验异常相结合是最有价值的FAS突变型ALPS患者的预测指标。(Blood.;(17):-)前言自身免疫性淋巴细胞增生综合征（ALPS；也被称为Canale-Smith综合征）是一种罕见的免疫缺陷病，包括几个病理特征：如非恶性慢性淋巴细胞增生、不明原因淋巴结病、脾肿大、免疫介导的血细胞减少、以及由于外源性FAS介导的细胞凋亡通路异常而引起的高丙种球蛋白血症[1-3]。淋巴细胞凋亡缺陷常导致自身免疫性表现，主要为多系血细胞减少，较少出现肾炎、肝炎、葡萄膜炎、关节炎或结肠炎。此外，ALPS患者及其有同样基因学异常但无ALPS表型的同胞倾向于易患一些恶性肿瘤，如实体瘤（如甲状腺癌、乳腺癌、肝癌）和白血病；患非霍奇金淋巴瘤的风险也比一般人群高50倍[4-6]。在ALPS中，外源性凋亡信号通路缺陷是由于编码FAS细胞表面死亡受体蛋白、FAS配体（FASligand,FASL）蛋白、半胱氨酸蛋白酶10的FAS基因（TNFRSF6、CD95、AP01）、FASLG基因和CASP10基因发生胚系突变和体细胞突变造成的[7]。大多数ALPS患者存在FAS基因的胚系杂合突变或体细胞获得性突变。罕见情况下，FAS突变也可通过常染色体隐性方式遗传[2,3,8,9]。FAS基因编码在B淋巴细胞和T淋巴细胞上表达的蛋白受体。此外，ALPS病例还存在FASLG基因突变，这种情况极其罕见[10]。基于潜在的致病基因变异，根据受影响基因的不同ALPS可分为4个亚型，包括ALPS-FAS、ALPS-FASLG和ALPS-CASP10[2,7]；这些未发现所述基因突变的ALPS患者（20%-30%的病例）被归类为ALPS-U型（不明原因型）[2,6,8,11-17]。对于由于致病性半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8，CASP8）基因变异，引起caspase-8缺陷的患者定义为患有ALPS相关疾病，其特征是在FAS诱导的淋巴细胞凋亡缺陷基础上，伴有T、B淋巴细胞和NK细胞活化障碍[2,10,18]。ALPS患者中活化诱导的细胞死亡导致异常的T淋巴细胞增生[19]。年首次报道了自身反应性CD3+TCRαβ+CD4-CD8-双阴性T细胞（double-negativeT-cell,DNT）集聚是ALPS的主要特征。该细胞群体通常约占副皮质区和正常人外周血（peripheralblood,PB）T淋巴细胞亚群的1%[20,21]。DNT与正常分化的T淋巴细胞相似，通常在其细胞表面表达初始T淋巴细胞的表面抗原标志，如CD45RA。但这些细胞具有高度增殖性，并能够在哺乳动物中诱导上调雷帕霉素靶点和其他几种增殖信号通路[15,22]。辅助T细胞类型偏倚和CD27+记忆B细胞数量减少也被报道。ALPS其他重要的实验室特征包括：可溶性FAS配体（solubleFASL,sFASL）、白介素-10（interleukin-10,IL-10）和IL-18水平升高。本回顾性研究旨在通过评估例具有ALPS临床证据的患者，包括临床表现、实验室检查和分子遗传学检查结果等信息，重新审视年ALPS诊断标准[3]，并明确诊断ALPS最有预测性和实用性的生物标志物及其组合。研究方法队列描述年和年期间，例ALPS临床疑似病例（例男性患者和83例女性患者；中位年龄，12.3岁；范围，1个月-76岁）的血液样本被医院免疫学实验室（英国伦敦）。这些患者分属于个没有血缘关系的家庭。临床资料包括是否存在慢性非肿瘤性、非感染性淋巴结病和/或脾肿大、血细胞减少、免疫球蛋白G（immunoglobulinG,IgG）和维生素B12水平。免疫实验室评估了DNTs，进行了淋巴细胞凋亡功能试验，并测量了sFASL、IL-10和IL-18水平。基因分析在东北泰晤士地区遗传学实验室（英国伦敦）进行。回顾性收集患者临床、免疫学和遗传学实验室数据，及现有的临床结果数据。本研究获得布卢姆斯伯里研究伦理委员会批准，并严格按照赫尔辛基宣言进行。实验室参数评估利用流式细胞仪检测CD3+TCRαβ+CD4-CD8-DNTs。根据本实验室的流式细胞学设门策略，DNTs致病水平被确定为DNTs占所有α/βT细胞比例1.8%[2,23]。采用抗CD3单抗和IL-2刺激PB单核细胞6-7天，使用这种PB单核细胞进行体外FAS介导的细胞凋亡试验。孵育后，采用抗FAS抗体刺激细胞引起细胞凋亡。通过细胞膜蛋白（膜联蛋白V）表面染色检测细胞凋亡。凋亡细胞的流式细胞学表现为膜联蛋白V阳性，但是DNA活力染色（7AAD）阴性。在正常人中，抗FAS抗体刺激样本比未刺激样本的差异变化3.0倍[23]。在ALPS患者中，抗FAS抗体治疗后膜联蛋白V的表达水平通常较低。将无血缘健康者样本作为对照组，对该对照组进行评估，每位患者样本作为可能影响该功能测定结果的变量（如转运、温度、试剂）的质控样本。正常膜联蛋白V的倍数变化定义3.0；如2.0倍数变化定义为细胞凋亡缺陷；2.0-3.0之间的范围定义为细胞凋亡可疑缺陷[2,3]。采用RDsystems公司的人IL-10定量ELISA试剂盒（DB）、人IL-18定量ELISA试剂盒（DL）和人FAS配体/TNFSF6定量ELISA试剂盒（DFL00B）。正常值范围分别为40、和pg/mL。维生素B12的正常范围为-pg/mL，IgG正常范围为5.4-16.1g/L。遗传学研究利用二代测序（next-generationsequencing,NGS）技术分析影响外源性凋亡通路（FAS、FASLG、CASP10）基因和另外79个与免疫缺陷和胃肠富集相关的基因[24]。库制备使用SureSelectXT定制试剂盒，然后在IlluminaMiSeq上进行测序。根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）的推荐规范评估检测到的基因突变[25]。利用基于网络的VarSome进行突变注释和分类[26]。用HumanSplicingFinder软件评估潜在的剪接变体[27]。发现的基因突变进一步利用Sanger测序进行验证。应用诊断性评估利用年ALPS国际诊断标准评估患者的临床症状和实验室检测生物标志物[3]，年ALPS国际诊断标准包括4个主要的标准：（1）慢性非肿瘤性淋巴细胞增生（6个月）伴有脾肿大和/或淋巴结病；（2）PB中DNT升高（1.8%）；（3）FAS介导的体外细胞凋亡缺陷；（4）检测到致病性基因突变（FAS、FASLG和CASP10基因）。除4个主要诊断标准外，有6个次要诊断标准：包括多系血细胞减少、血清中IgG、IL-10、IL-18、维生素B12和血浆sFASL水平升高。符合至少3个主要标准或符合2个主要标准+2个次要标准即可明确诊断ALPS。本研究诊断标准根据欧洲免疫缺陷疾病协会的原发免疫缺陷病的定义进行了更新[28]，在欧洲原发免疫缺陷病的定义中DNT升高是主要诊断标准，但不是必要标准。诊断标准亦进行了扩展，符合2个主要诊断标准+1个次要标准被定义为疑似APLS患者；其包括了在就诊时可能接受免疫抑制治疗的患者。对于缺乏2个以上主要诊断和1个次要诊断标准相关信息的病例定义为不可评估病例。统计分析对于连续性变量的分析，采用Shapiro-Wilk检验确定正态分布。检查的参数无一显示正态分布，那么采用Kruskal-wallis或Mann-WhitneyU检验进行分析，并采用Dnn’s检验进行事后分析。对于分类变量分析，采用了Pearson’sχ2检验进行分析。数据分析采用IBMSPSS统计软件23.0版本、PrismGraphPad和MicrosoftExcel进行。图1.纳入本项研究患者的诊断结果。共例临床怀疑ALPS的患者纳入本研究。评估的最低标准是至少符合2个主要诊断标准+1个次要诊断标准，例患者进行了评估。如至少符合3个主要诊断标准，或者至少符合2个主要诊断标准+2个次要诊断标准，则可确诊为ALPS患者。如至少符合2个主要诊断标准+1个次要诊断标准，则可视为疑似ALPS患者。结果临床及实验室检查纳入研究的具有ALPS临床特征的例患者中，有87例患者有临床记录信息，包括淋巴细胞增生、淋巴结病和脾肿大；例患者有白细胞、血红蛋白和血小板计数检测数据。例患者有DNT检测结果，例患者进行了体外凋亡功能试验，86例有遗传学检查结果（如图1）。此外，免疫球蛋白IgG（n=66）、维生素B12（n=31）、sFASL（n=）、IL-10和IL-18（n=30）水平被检测。75例患者被归类为不可评估病例。在可评估患者中，38例患者（27.1%）符合确诊ALPS标准（初次就诊中位年龄，9.3岁；范围，4个月-77岁，见补充图1，Blood杂志网站提供）。另外17例患者（12.1%）符合疑似ALPS标准（初次就诊中位年龄，13.1岁；范围，1个月-19岁，补充图1），85例患者（60.7%）不符合ALPS诊断标准（非疑似ALPS组；初次就诊中位年龄，10.3岁；范围，2个月-64岁）。确诊ALPS组（n=33/34[97.1%]）和疑似ALPS组（n=14/16[87.5%]）患者与非疑似ALPS组（n=22/40[55%]；P0.0）相比，更符合ALPS临床标准，包括慢性淋巴细胞增生，伴有/或没有淋巴结病/脾肿大。多系血细胞减少在确诊ALPS组、疑似ALPS组和非疑似ALPS组中的发生率分别为69%（n=20/29）、56.3%（n=9/16）和56.6%（n=30/53）（P=0.；图2A）。部分患者具有预后数据。在34例确诊ALPS患者中，有3例（n=3/34[8.82%]）和3例疑似ALPS患者（n=3/16[19.75%]）进行了脾切除术。2例确诊ALPS患者（n=2/34[5.88%]）进展为淋巴瘤。确诊ALPS组（n=34）和疑似ALPS组（n=14）所有患者均出现DNT异常升高。而非疑似ALPS组患者中，68例患者中有35例（51.5%）显示DNT升高。中位DNT发生率在确诊ALPS患者中为3.95%（范围，1.8%-23.0%），在疑似ALPS患者中为2.6%（范围，1.9%-6.7%)，在非疑似ALPS患者中为1.85%（范围，0.0%-13.9%）。确诊APLS患者DNTs显著高于非疑似ALPS患者（P0.0），疑似ALPS患者DNTs高于非疑似ALPS患者（P=0.；图2B）。在确诊ALPS组（n=33）中，15例患者凋亡功能试验异常（45.5%），11例患者凋亡功能试验结果可疑（33.3%），7例测试结果正常；在疑似ALPS组（n=16）中，2例患者凋亡功能试验异常（12.5%）；2例患者凋亡功能试验结果可疑（12.5%），12例患者凋亡功能试验结果正常。在非疑似ALPS组（n=80）中，分别有3例和8例（3.8%和10%）患者凋亡功能试验异常或可疑。在确诊ALPS组中，膜联蛋白表达变化中位数是2.1倍（范围，0.4倍-6.7倍）。在疑似ALPS患者组中，膜联蛋白表达中位数为4.8倍（范围，1.3倍-18.1倍），而非疑似ALPS组中，中位数是5.2倍（范围，1.1倍-30.5倍）。确诊ALPS组膜联蛋白表达显著高于疑似ALPS患者组（P=0.9）和非疑似ALPS患者组（P0.0）。但疑似ALPS组膜联蛋白表达与非疑似ALPS组相比无明显差异（P=0.；图2C）。sFASL水平在确诊ALPS组和非疑似ALPS组有显著差异（P=0.3；确诊ALPS组，中位数，pg/mL；范围，44-pg/mL；疑似ALPS组，中位数，pg/mL；范围，23.5-pg/mL；非疑似ALPS组，中位数pg/mL；范围，35-pg/mL；图2D）。与疑似ALPS组（中位数，24.2pg/mL；范围，20.5-27.9pg/mL）和非疑似ALPS组（中位数，23.8pg/mL；范围，8-.6pg/mL；P=0.；图2E）相比，IL-10水平在确诊ALPS组有升高趋势（中位数，41.8pg/mL；范围，19-.2pg/mL）。此外，在确诊ALPS组（中位数，pg/mL；范围，-pg/mL）、疑似ALPS组（中位数，pg/mL；范围，-pg/mL）和非疑似ALPS组（中位数，pg/mL；范围-5pg/mL）中IL-18水平亦有升高趋势（P=0.；图2F）。图2.患者的实验室检查标志物和临床指标数据。（A）入组患者的临床资料：淋巴细胞增生（P0.0，确诊ALPS组vs非疑似ALPS组）和多系血细胞减少（P=0.）。（B）DNTs。（C）体外凋亡功能试验。（D）sFASL水平（P=0.，确诊ALPS组vs疑似ALPS组）。（E）IL-10（P=0.确诊ALPS组vs疑似和非疑似ALPS组）。（F）IL-18（P=0.确诊ALPS组vs疑似和非疑似ALPS组）。（G）临床标志物组合评估，比较确诊ALPS组和非疑似ALPS组。所有数据以中位数±四分位距表示。*P=0.%（疑似ALPS组vs非疑似ALPS组），**P=0.9（确诊ALPS组vs疑似ALPS组；C栏)，**P=0.3（确诊ALPS组vs非疑似ALPS组；D栏），****P0.0（确诊ALPS组vs疑似ALPS组；B栏)，****P0.0（确诊ALPS组vs非疑似ALPS组；C栏）。生物标志物组合检测最佳生物标志物组合是通过设置两组标记物，这两组标志物均为阳性，或其中一种标志物为阴性进行检测；这种生物标志组合在确诊ALPS组和非疑似ALPS组间进行了比较（图2G）。DNTs与体外凋亡功能异常试验组合，在确诊ALPS组中阳性率为79.3%（n=23/29）；而在非疑似ALPS组中阴性率为93.7%（n=59/63）；因此，该组合诊断ALPS的灵敏性为79.3%，特异性为93.7%。DNT和sFASL组合在确诊ALPS患者中的阳性率为41.9%（n=13/31)；在非疑似ALPS组中阴性率为87.2%（n=41/47)；因此，该组合诊断ALPS的灵敏性为41.9%，特异性为87.2%。体外凋亡功能试验和sFASL检测组合在确诊ALPS组中阳性率为36.7%（n=11/30），在非疑似ALPS组中阴性率为96.4%（n=53/55），因此，该组合诊断的灵敏性为36.7%，特异性为96.4%。所有3项检测组合在确诊ALPS组和非疑似ALPS组中均显示出显著差异（P0.0，DNT联合体外凋亡功能试验；P=0.，DNT联合sFASL；P=0.02，体外凋亡功能试验联合sFASL）。分子遗传学检测结果本研究中87例患者具有遗传学检测结果。我们考虑根据ACMG关于可能改变功能获得性基因突变指南，将分子遗传学结果分为致病性突变、可能致病性突变和无义突变（variantsofunknownsignificance,VUSs）（表1）。突变发生频率比ALPS发病率要高，因为其中包含不改变蛋白质功能的可能良性/良性的突变（如不影响剪接位点的内含子，同义的外显子，或计算机功能预测中性/可耐受的突变，如Provean、SIFT和MetaSVM）。并回顾分析了既往临床和体外功能方面关于基因突变的研究。本研究中有21例患者发现FAS基因突变，其中17例患者的FAS基因突变被认为是潜在的功能性突变（14例为确诊ALPS患者，1例为疑似ALPS患者）。其余2例因缺乏足够的临床或实验室资料，未行评估（1例患者是在疾病家族筛查中发现）。两个移码突变和2无意义的致病性突变以杂合子的形式在4个确诊ALPS患者中被检测到。其中3个功能缺失突变在之前未见文献报道（c._delGTCATGA，p.ValHisfsTer2；c._delinsAGTTA，p.MetLysfsTer7；和c.76CT，p.Gln26Ter），而1个无义突变（c.CA，p.Cys73Ter）已被报道[4,29]。关于可能致病性FAS错义突变，有3个新的（c.TG，PheVal；c.AG，AspGl；和c.CA，GlnLys）和2个已报道过的（c.GA、ArgGln和c.TG,IleArg）[30,31]基因突变被检测到。有趣的是，2例具有曾认为可能致病性错义突变的患者FAS介导的体外凋亡试验结果正常。内含子c.-9_-6delATTT突变属于VUS（在健康人群中未被发现；在ALPS患者中其内含子位置不影响保守性剪接区域）。该突变靠近受体剪接位点，计算机功能预测表明该突变改变了剪接位点，很可能影响基因剪接[27]。研究中检测到下列良性FAS基因突变。FASc.AC（p.Thr46Pro）根据ACMG标准被归类为VUS。该变异在1例两岁的患者身上被检测出，但患者没有表现出ALPS特有的生物标志物阳性，这减少了这种基因突变在ALPS中发挥致病作用的可能，但不能完全排除。不能排除患者存在将来进一步发展为ALPS的可能。一个FAS同义变体（c.TC）和5个FAS基因内源突变在3例患者中被检出，但这些小单核苷酸多态性的等位基因突变在普通人群中发生频率远高于ALPS预期的发病频率（同义突变也可与曾报道过的致病性突变CASP10同时发生）。在我们可评价的且有足够的临床资料的患者中没有检测到体细胞FAS突变。这可能与基因测序分析的敏感性低有关，因为未对分类的DNT进行遗传分析。在致病性FAS变异患者组中，其中14例患者出现DNT水平异常，3例患者无检测结果。9例患者体外淋巴细胞凋亡功能试验异常，2例患者可疑异常，3例患者正常，其他3例患者未进行检测。5例患者检测到CASP10突变（2例确诊ALPS患者，1例疑似ALPS患者和2例不可评估患者）。已有研究报道CASP10突变（c.AT；p.IleLeu）为ALPS的致病基因突变；体外功能研究亦证实其致病性，尽管它的MAF（0.4%）和计算机功能预测分析其为良性变异（ACMG分类：可能良性突变）[32]。CASP10p.IleLeu突变在2例渊源者（分别为确诊ALPS患者和疑似ALPS患者）和2名家庭成员（不可评估病例）检出。CASP10c.AG（p.Lys99Glu）在1例确诊ALPS患者身上检测出，这个突变未曾报道与ALPS相关，且在一般人群中MAF低（0.04%）。因为计算机预测分析结果不明确，ACMG分类可能是良性的。CASP10c.1GA（p.ValIle）在1例患者中检出并与另一个错义CASP10突变（c.A.T）共存，这支持其良性突变的预测[28,33,34]。伴有可能致病性或良性CASP10变异ALPS患者的DNTs（n=2）升高，但体外细胞凋亡功能检测与sFASL正常。具有潜在致病性新FAS突变和CASP10突变的ALPS患者的临床表现和实验室标记在表2中列出。FASLG和CASP8致病突变在本研究的确诊ALPS和疑似ALPS患者中未被检出。在本研究ALPS-U患者组中，靶向检测免疫缺陷基因和胃肠道富集的NGS检测，在6例确诊ALPS患者和4例疑似ALPS患者中检测到致病性突变、可能致病性突变、无义突变（表3）。在本研究队列中还检测到以下受到影响的基因：核因子κB激酶调节亚基γ抑制因子（IKBKG）、ORAI钙释放-活化钙调制器1（ORAI1）、肌球蛋白VB（MYO5B）、穿孔素1（PRF1）、重组激活蛋白1（RAG1）、信号转导和转录激活因子-3（STAT3）和TNF受体超家族成员13B（TNFRSF13B）。所有临床数据完整的患者均观察到淋巴细胞增生和DNTs升高。ALPS-FAS与ALPS-U的比较在确诊ALPS组和疑似ALPS组中，ALPS-FAS亚型患者（n=13/17）DNT水平（中位值，7.5%；范围，4.5%-23%）明显高于ALPS-U亚型患者（n=32/35；中位值，2.7%；范围，1.8%-11%；P0.0；图3A）。ALPS-FAS亚型患者的体外凋亡功能试验受损（n=14/17；中位值，1.6；范围：0.4-3.5）重于ALPS-U亚型患者（n=31/35；中位值，3.1；范围，1.3-18.1；P0.0；图3B)。尽管sFASL被证明是ALPS-FAS亚型的高预测性生物标志物（n=16/17；中位值，pg/mL；范围，.9-pg/mL)，但sFASL水平在ALPS-U亚型绝大多数患者中正常或中度增高（n=29/35；中位值，pg/mL；范围，23.5-pg/mL；P0.0；图3C）。表1.患者队列中发现的FAS和CASP10基因变异基因变异（编码序列和蛋白质变化）是根据人类基因组变异学会（HumanGenomeVariationSociety,HGVS）的命名规则列出的。ACMG的分类是根据种群频率，之前的文献数据以及在诸如Provean、SIFT、MetaSVM等预测中显示的。HSF，HumanSplicingFinder（基于web的剪接位点预测）；MAF，小等位基因频率；NA，不适用；SNP，单核苷酸多态性。ALPS-FAS与ALPS-U两亚型间IL-10水平未见显著异常（ALPS-FAS亚型：n=4/17；中位数，96.8pg/mL；范围，19.9pg/mL-.2pg/mLvsALPS-U亚型：n=15/35；中位数，36.8pg/mL；范围，19pg/mL-.3pg/mL；P=0.）。而ALPS-FAS亚型（n=9/17；中位数，pg/mL；范围pg/mL-pg/mL）与ALPS-U亚型（n=13/35；中位数，pg/mL；范围，pg/mL-3pg/mL；P=0.；图3D-E）相比，IL-18水平有增加趋势。诊断标志物组合方面，DNT和体外淋巴细胞凋亡试验联合检测在鉴别ALPS-FAS和ALPS-U亚型上，具有最好的灵敏性（90.9%），阴性预测值达93.8%。相反，体外凋亡功能试验和sFASL联合检测对于ALPS-FAS亚型的诊断具有最高特异性92%，阳性预测值（positivepredictivevalue,PPV）为83.3%。所有这3种标志物组合在ALPS-FAS亚型中均更易出现异常结果（P=0.05，DNT联合体外细胞凋亡功能检测；P=0.0，DNT联合sFASL；P0.0，sFASL联合体外凋亡功能试验；图3F）。讨论ALPS是一种临床和遗传学上异质性的疾病，缺乏特异性的症状和体征。自年该病首次被报道后，先后制定了几个ALPS诊断标准以概括和明确这个罕见疾病的特征。0年至今所有版本诊断标准均包括了相似的临床特征和生物标志物，仅是组合和优先顺序不同[2,3,35,36]。由欧洲免疫缺陷协会在年出版的ALPS临床诊断最新工作中允许多种生物标志物的组合，但是没有提到其严格标准，如DNT升高或淋巴细胞增生[36]。因此这个诊断标准有利于识别早期无症状或轻微疾病患者，甚至是此前接受过免疫抑制治疗的患者。正在接受免疫抑制治疗或治疗后的患者，其DNT、体外细胞凋亡功能检测、sFASL和IL-10水平可能正常或轻度异常[37,38]。因此，我们对疑似ALPS分类的诊断标准进行了扩展（即符合2个主要诊断标准和1个次要诊断标准），包括临床表现与ALPS相似的所有患者，即使他们的生物标志物仅轻度异常或无法获得。本研究的局限性之一是在患者就诊时方进行临床数据收集和生物标志物分析，因此，未来进行脾切除术和发展为淋巴瘤的发生率无法评估，且不能排除患者既往或正在进行免疫抑制治疗可能。本研究结果支持目前普遍接受的诊断标准[2,3,36]，即淋巴细胞增生（伴/不伴脾肿大和/或淋巴结病）是ALPS最重要的临床表现。在本研究的确诊ALPS患者中淋巴细胞增生的发生率为97.1%，这与之前的其他报道相似[5]。此外，所有确诊ALPS和疑似ALPS患者在进行检测时均有DNTs增高[2,3,36]。但本研究中非疑似ALPS组也有51.5%的患者DNTs水平异常，因此，DNTs的特异性（50%）和PPV（43%）均相对较低，与既往报道一致[39]。几种类型的免疫缺陷病，如伴有镁缺乏的X连锁免疫缺陷病、EB病毒感染和肿瘤[40]、自身免疫性疾病，例如青少年系统性红斑狼疮、混合结缔组织病和严重感染[41,42]，均可导致DNTs升高[43]。相比之下，体外凋亡功能的异常率在确诊ALPS患者中为78.8%，而在非疑似ALPS患者中细胞凋亡功能异常发生率仅为13.8%。因此，这个生物标志物对ALPS显示出高特异性（92.2%）和高PPV（78.8%）。根据本研究发现，这些生物标志物联合检测诊断的灵敏性是79.3%，特异性为93.7%。当两种诊断标志物水平存在异常支持ALPS诊断，反之如果两种生物标志物检测均在正常范围内，可排除ALPS诊断。尽管所有ALPS患者均有sFASL水平显著升高，但与DNT联合体外凋亡功能试验相比，其联合检测（如DNT和sFASL、体外凋亡功能试验和sFASL）并没有提高诊断特异性，反而使诊断灵敏性下降。在临床评估中考虑了IL-18、IL-10、IgG和维生素B12水平，但因为患者数量有限，其联合检测的诊断价值在研究中未被评估。与确诊ALPS患者相比，疑似ALPS组患者除DNTs升高外，多数生物标志物轻度异常；仅体外凋亡功能试验有明显差异及sFASL水平存在差异趋势（图2C-D）。其原因可能与患者早期接受免疫抑制剂治疗或者疾病处于早期阶段相关。本研究包含了较多FAS基因突变的患者，在10个独立的家庭中共发现17例患者。致病性或可能致病性的FAS基因突变可能导致单倍体不足（无意义和移码突变）或者干扰死亡受体FAS与衔接蛋白FADD寡聚体的相互作用。包括我们研究新发现的突变在内的所有致病性错义突变均影响了FAS蛋白的死亡结构域（c.-c.），引起显著的显性负效应[44]。本研究中唯一发生在FAS结构域之外（c.AG）的非同义错义突变，出现在一个非疑似ALPS患者中，因此降低了该突变是致病性突变的可能（虽然Varsome分类为VUS）。有趣的是，早期FAS终止密码子无义突变在本研究ALPS患者队列中产生了不同的症状。例如，第39号患者的临床症状和实验室结果支持ALPS诊断，但其体外凋亡功能试验正常；而存在无意义FAS突变的第号和49号患者体外凋亡功能试验异常。对于这种情况最可能的解释是第39号患者的基因突变影响了FAS的细胞外区域，导致单倍体量不足，而第号和第49号患者的基因突变影响了细胞内区域，引起显性负效应。有研究报道FAS受体胞内区域突变引起的外显率高于细胞外域突变[4,30]。表2.有新的基因变异的ALPS患者的临床和实验室检测结果A，贫血；Het，杂合；N，中性粒细胞减少症；NA，不适用；T，血小板减少症。*符合标准（主要标准+次要标准），未将基因突变作为主要标准。表3.有基因突变的ALPS-U亚型患者的临床和实验室检测结果A，贫血；Het，杂合；Homo，纯合子；N，中性粒细胞减少症；NA，不适用；T，血小板减少症。图3.ALPS-FAS亚型和ALPS-U亚型的实验参数变化。所有确诊ALPS和疑似ALPS患者按基因突变结果分为ALPS-FAS亚型和ALPS-U亚型。（A）DNTs。（B）体外凋亡功能试验。（C）sFASL。（D）IL-10（P=0.）。（E）IL-18（P=0.）。（F）评估实验室参数组合以鉴别ALPS-FAS和ALPS-U。所有数据以中位数±四分位距表示。****P0.0。本研究采用PB样本进行遗传筛选。因此，没有在细胞亚群中分析体细胞突变。对NGS检测范围进行了优化以检测胚系突变。将来，希望在分选的DNT部分进行FAS基因突变测序，以区分具有体细胞FAS突变的ALPS和ALPS-U。在本研究中37例患者分类为ALPS-U亚型，其中有10例存在FAS或CASP10基因以外的突变，这些突变基因绝大多数已被证实与免疫失调有关。根据目前可获得的数据，在ALPS-U亚型中发现的IKBKG、ORAI1、MYO5B、PRF1和RAG1基因产物与Fas介导细胞凋亡通路无互相作用。IKBKG和ORAI1基因在伴有免疫缺陷的外胚层发育不良中起作用。有趣的是，在IKBKG基因突变的患者中发现DNTs升高；但是，这部分患者以前并无研究报道出现过体外凋亡功能试验异常[45]。MYO5B基因与胃肠道微绒毛包涵体病相关，其临床特征包括胃肠道和神经系统症状，但其与淋巴细胞增生无关。PRF1基因突变会导致家族性噬红细胞淋巴组织细胞增生症，该病与ALPS具有相同的临床症状，如脾肿大和血细胞减少。值得注意的是，在ALPS-U亚型患者中发现PRF1c.CT和c.AG基因突变是健康人群中很常见的突变，MAF分别为2.9%和0.5%。可能致病性的RAG1突变（c.CT）与奥曼综合征有关；该病是一种常染色体隐性遗传的严重联合免疫缺陷病。有研究报道RAG1基因复合杂合子突变与Evans综合征发生有关[46]。有趣的是，本研究患者检测到的是RAG1纯合子突变。本研究中2例无血缘关系的患者中检测到STAT3（c.CT）基因致病性功能获得性突变，其可引起淋巴细胞增生、自身免疫和反复感染[47]；这个突变在Evans综合征中曾被报道[46]。TNFRSF13Bc.TC是一种常见的功能性突变，其影响受体与配体的结合和信号转导通路；其杂合型突变在常见变异型免疫缺陷病患者中的发生率为2%-5%，在健康人群中的发生率为0.5%-1%[48]。Teachey等报道，常见变异型免疫缺陷病患者可表现出类似ALPS的临床特征。在ALPS-FAS亚型中，所有患者的多数实验室检查标志物均明显异常，如DNTs、凋亡功能检验和sFASL水平，这与既往研究相似[37,39,49]。但ALPS-U亚型患者的凋亡功能检验和sFASL水平多为正常。这支持既往研究结论：即ALPS-U患者没有可检测到的实验室标志物，支持该类患者的外源细胞凋亡通路中存在致病机制。此外，高体外凋亡功能试验评分和高sFASL水平，这两项指标可以推测诊断ALPS-FAS，两者联合检测诊断的特异性是92%，PPV是83.3%（图3F）。应用ACMG标准进行致病性预测在CASP10基因错义突变患者中存在争议。该突变在健康人群中的MAF值为0.04%-4%，且与计算机功能预测的不一致，计算机预测大多为中性或可接受的结果，导致可能是良性或良性的ACMG分类结果。在本研究中，CASP10c.AT（MAF4%，丹麦[33]）突变患者同时合并CASP10其他错义突变也支持这一预测。本研究认为CASP10c.AT可能是一种VUS/可能的致病性突变，因为体外凋亡功能试验证实ALPS患者存在凋亡功能缺陷[28]。CASP10cAG突变尚未见文献报道。ALPS-CASP10亚型患者的生物标志物数据很少；有趣的是，本研究中无1例ALPS-CASP10亚型患者存在体外凋亡功能试验异常和sFASL升高。但因为样本量较少，这一趋势尚未得到统计学证实。具有CASP10突变的患者体外凋亡功能试验未见异常。因此，FAS介导的凋亡试验和sFASL水平检测在ALPS-CASP10亚型诊断过程中的价值存在质疑，需进一步研究证实。与既往研究一致，本研究患者队列中未检测到致病性FASLG和CASP8基因突变，进一步支持了这些基因突变的发生率很低的结论[2,10,18]。本研究结果证实了年新诊断标准中确定的主要和次要诊断性生物学标志物有助于ALPS诊断。然而，这些诊断性生物学标志物并非在所有ALPS亚型中均存在明显异常。如果患者没有淋巴结肿大和/或脾肿大，且DNTs水平正常，其患ALPS的可能性极小。因为DNTs检测容易，其应作为临床怀疑ALPS患者的首选筛查方法。如果DNTs结果正常，则不需进一步检查，除非患者临床高度怀疑ALPS。对其他一些非免疫学参数是否可也作为ALPS诊断的生物学标志物也进行了评估，如维生素B12或高密度脂蛋白[39,49]。ALPS患者的淋巴细胞可产生一种维生素B12的转运蛋白——咕啉结合蛋白，咕啉结合蛋白的异常合成和释放会导致ALPS患者维生素B12水平升高[50]，而患者IL-10水平升高是血清脂蛋白改变的直接原因[51]。这些非特异性但容易检测的生物学标志物（如高密度脂蛋白）并未在所有患者中检测或记录，因此，不能对上述数据进行总结分析，这是本研究的缺陷。本研究结果支持DNTs水平升高是ALPS诊断关键的主要标准（但如DNTs不能检测，其不是必要标准）。使用生物标志物联合检测（DNTs、体外凋亡功能试验和sFASL检测）能够加速证实或排除ALPS诊断，尤其是在不具备分子学检测的情况下。这些可靠的血液学生物标志物可通过基因检测（包括FAS和CASP10）替代分子学检测，降低了诊断费用。而基因测序检查可用于那些临床高度怀疑ALPS，但生物标志物联合检测不符合ALPS特征性表现的患者。这种诊断策略可使ALPS的快速诊断和及时治疗变得方便可行，并降低诊断费用。本研究结果将有助于指导针对ALPS诊断的生物标志物联合检测方法的应用，从而实现ALPS的快速诊断和资源最优化利用。致谢AcknowledgmentsTheauthorsacknowledgethestaffoftheGreatOrmondStreetHospitalImmunologyLaboratoryandtheNorthEastThamesRegionalGeneticsServiceforhelpingtoanalyzethesesamples.ThisresearchwassupportedbytheWell