胰腺导管腺癌(PDAC)是一种致命疾病，5年生存率6%。传统的化疗和放疗对PDAC的治疗效果并不理想。免疫治疗是近年来新兴治疗肿瘤的方法，在黑色素瘤等肿瘤治疗中取得了显著的效果，但由于PDAC独特的免疫抑制肿瘤微环境（TME）和较低的免疫原性，免疫治疗的效果并不明显。
为了提高免疫治疗在胰腺导管癌中的应用，来自上海复旦大学药学院药剂科教育部智能给药重点实验室、医学神经生物学国家重点实验室和教育部脑科学前沿中心蒋晨教授团队将最新成果发表在Biomaterials上，题目为“Pancreaticcancer-targetingexosomesforenhancingimmunotherapyandreprogrammingtumormicroenvironment”。
在胰腺导管癌的肿瘤微环境中，间质细胞几乎占据肿瘤块的90%，但只有少数免疫细胞具有抗肿瘤活性，大多数免疫细胞被劫持后被迫促进肿瘤的发展（如：骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)、M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)以及调节性T细胞(Tregs)）。最近人们发现，半乳糖凝集素-9(gal-9)是凝集素β-半乳糖苷结合家族的一员，在小鼠和人的PDAC中均高表达。gal-9通过与巨噬细胞表面的先天免疫受体dectin-1相连接，可以驱动巨噬细胞向M2表型发生极化。阻断gal-9可逆转免疫抑制，增强CD4+和CD8+T细胞激活，抑制肿瘤生长。gal-9有可能成为PDAC免疫治疗的新靶点。
为了提高药物穿过生物屏障进入肿瘤细胞的能力及靶向性，蒋晨团队设计了一种骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源的外泌体，在PDAC小鼠模型中有很好的肿瘤靶向能力，可用作PDAC药物的递送平台。另一方面，由于PDACTME中效应T细胞含量较少，在本研究中通过化疗诱导的免疫源性细胞死亡（ICD）来触发肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应，提高治疗效果。具体的设计思路如图1所示，奥沙利铂(OXA)用于触发胰腺肿瘤部位的ICD效应，并通过抑制DNA合成和修复来杀死肿瘤细胞；gal-9siRNA治疗用于阻断gal-9/dectin-1通路，抑制巨噬细胞向M2型极化。用外泌体作为两种治疗药物的载体，制备成siRNA-EXO-OXA纳米粒子。
图1用于增强免疫治疗和重新编程肿瘤微环境的胰腺癌靶向外泌体。1)由化疗剂奥沙利铂引起的肿瘤细胞凋亡；2)通过siRNA处理下调gal-9以实现抑制巨噬细胞M2型极化；3)奥沙利铂触发的ICD反应，死亡的肿瘤细胞在表面暴露钙网蛋白（CRT），释放高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）以激活DC成熟。
首先是siRNA-EXO-OXA纳米粒子的制备，采用差速离心法从BM-MSCs培养基上清液中分离出外泌体。gal-9siRNA经电穿孔进入外泌体。用N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺修饰奥沙利铂，合成前体药物OXA-MAL，再对外泌体进行修饰得到siRNA-EXO-OXA纳米粒子，其表征如图2所示。
图2iEXO-OXA的表征。a)iEXO-OXA的制备方案；b)外泌体直径和浓度的NTA结果；c)透射电镜观察到的外泌体的形态(标尺:nm)；d)westernblotting检测外泌体生物标志物；e)iEXO-OXA直径和浓度的NTA结果；f)透射电镜观察iEXO-OXA的形态(标尺:nm)。
有效的细胞摄取是药物发挥作用的关键，基于体外PANC-02细胞对外泌体摄取的特性，研究人员进一步检测了外泌体在PANC-02荷瘤小鼠体内的肿瘤靶向能力。尾静脉注射Bodipy-iEXO-OXA、Bodipy-EXO和free-bodipy(作为对照)后，观察成像如图3所示，可以看出Bodipy-iEXO-OXA组有很好的靶向及肿瘤穿透能力，在体内的循环时间也比较长可以提高细胞摄取效率，提高PDAC的原发性肿瘤靶向能力，满足抗肿瘤药物载体的基本要求。
图3iEXO-OXA的体内靶向作用。a)尾静脉注射Bodipy、Bodipy-EXO和Bodipy-iEXO-OXA后小鼠体内IVIS成像；b)用不同组别制剂治疗48小时后，来自PANC-02小鼠模型的主要器官和肿瘤组织的离体IVIS成像；c)b中荧光强度的量化测量；d)和f)LCSM下的肿瘤组织免疫荧光图像；e)和g)量化信号统计结果。
随后，研究人员首先在体外验证了gal-9siRNA治疗后，下调gal-9的作用。如图4所示，iEXO可显著降低小鼠PANC-02细胞中gal-9的mRNA和蛋白水平。然后进一步评估iEXO在体外巨噬细胞极化中的作用，流式细胞分析结果显示iEXO组中M2样巨噬细胞显著减少，证明，iEXO可以有效下调PANC-02细胞中的靶基因，从而阻断肿瘤细胞与巨噬细胞之间的联系，防止体外巨噬细胞向M2型发生极化。体外进行了MTT试验，以证明基于OXA的制剂的细胞毒性作用。对ICD的标志物CRT/HMGB1/ATP进行检测有明显的提高。
图4iEXO-OXA的体外研究。通过a)蛋白质印迹和b)逆转录聚合酶链反应，gal-9在不同组别处理的PANC-02细胞中均有下调；c)通过流式细胞仪用不同制剂处理后的原代小鼠腹腔巨噬细胞极化；d)图c的统计结果；e)不同制剂的增殖抑制和IC50；f)流式细胞术细胞凋亡的数量；g)图f的统计结果；h)通过westernblotting用不同制剂处理后，PANC-02细胞上清液中的HMGB1分泌；i)图h的统计结果；j）荧光显微镜检测细胞凋亡；k)和i)ICD标志物CRT和HMGB1含量。
最后研究人员对纳米粒子进行了体内实验，证明了iEXO-OXA在体内依然有很好的抗肿瘤能力，并且不会造成全身毒性。
图5iEXO-OXA的体内抗肿瘤作用。a)药物治疗的时间表；b)肿瘤大小；c)统计生物发光；d)存活率；e)在4周治疗过程中小鼠的体重；f）IVIS在第7、14、21、28天的实时体内生物发光图像。
总的来说，本研究设计了一种基于外泌体的双重药物递送生物系统，通过诱导ICD刺激和干扰免疫抑制在小鼠原位PDAC中实现协同免疫应答。外泌体的肿瘤穿透能力进一步增强了药物在肿瘤区域的蓄积性，同时减少了全身分布以避免副作用。iEXO-OXA组合制剂通过增强ICD效应、促进DC成熟、逆转免疫抑制能够诱导有效的先天和适应性抗PDAC免疫。
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