肿瘤干细胞(CancerStemCells,CSCS)
肿瘤干细胞假说认为肿瘤细胞中有部分细胞具有自我更新、增殖、多向分化潜能，它们与癌症转移、复发或肿瘤药物抗性的相关，这群细胞被定义为肿瘤干细胞[1,2]。
对于癌症干细胞研究人员来说，如果能从肿瘤细胞中分离、培养肿瘤干细胞，建立可靠的肿瘤模型，进一步揭示肿瘤干细胞的功能特性和肿瘤发生机制，从而靶向消除干细胞样癌细胞群。该方案将有望成为治疗恶性肿瘤的可靠策略之一。基于文献阅读，小编今天和大家一起了解下如何从肿瘤细胞中分离培养肿瘤干细胞并建立肿瘤球模型。
建立培养法原理
常见三种分离CSCs的方法包括：建立培养法、MACS(磁性细胞分选)和流式分选(FACS)。因篇幅有限，今天我们先看看便捷有效的建立培养法。建立培养法乃基于肿瘤干细胞的生长特性，即在无血清、非贴壁的培养条件下，分化的肿瘤细胞将会死亡，而具有干性的肿瘤细胞会存活并增殖形成漂浮的细胞球[3]，如下图。
Fig.1.Morphologyofanchorage-independentgrowthperformedinsoft-agarupto15daysculturesfromprimarycoloncancercellsanddisaggregatedcoloncancerspherecells(40X).图片来源于文献3
肿瘤球培养步骤
虽然肿瘤球的来源和类型不同，但在体外扩增培养的流程基本一致[4]。简单来说，将肿瘤组织经酶消化或机械分离成单细胞悬液后，接种在含无血清培养基的超低黏附细胞培养板或培养瓶中（注意不要贴壁），培养过程中可以适当补充生长因子，如EGF,FGF。在此条件下，肿瘤干细胞将缓慢增殖，约1-2个月形成非粘附肿瘤球。
下面我们以神经胶质瘤为例[5]。
Fig.2.Generalprotocolsfortheestablishmentoftumor-derivedspheroids.CSC,cancerstemcell.图片来源于TheAuthors.CancerSciencepublishedbyJohnWileySonsAustralia,LtdonbehalfofJapaneseCancerAssociation.
1、将肿瘤组织样本在含有双抗的无菌PBS中洗涤、切碎并放入DMEM/F-12（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham营养混合液F12）无血清培养基（serum-freemedium,SFM）中。2、经酶或者机械法分离后通过40um的过滤器过滤，获得单细胞悬液。3、再通过低渗裂解去除红细胞。4、将细胞重悬于SFM中，活细胞计数。5、以每毫升20,个活细胞的密度铺板。（对于脑肿瘤干细胞球，可以使用两种条件：单独的SFM和补充有EGF，FGF2和硫酸肝素的SFM）。6、每周更换培养基。用SFM或含有EGF和FGF2的SFM等体积培养基替换原培养基的一半。最快一周后出现肿瘤球。7、球体至少生长3周且直径约-um进行下游实验，如CSCs鉴定、体内成瘤实验或者诱导分化。
Figure3.GBMbraintumorstemcells(BTSCs)proliferateintomultipotentspheresandself-renewwithoutexogenousmitogenicstimulation.(A,B):Phase-contrastphotomicrographsdemonstratethetypicalappearanceofGBMcellsgrownusingtheneurosphereculturesysteminSFMalone(withoutEGFFGF2);amonolayerofdifferentiatedcells(A)andafloatingGBMsphere(B).图片来源于ProliferationofHumanGlioblastomaStemCellsOccursIndependentlyofExogenousMitogensGBMBTSCSphereandHumanTemporalLobeCellCulture
产品名称货号Cultrex3-DSpheroidColorimetricAssay,96-well--KCultrex3DSpheroidCellInvasionAssay--KCultrex3-DSpheroidFluorometricAssay,96-well--KRe