杂志：NATUREREVIEWSGENETICS
IF：32.
发表日期：.3.24
摘要
随着测序技术的发展和测序成本的快速降低，数百个肿瘤相关基因的基因组图谱成为肿瘤常规诊疗的一部分，肿瘤基因组图谱可以辅助肿瘤精细化分型。本文综述了肿瘤基因组的研究现状，通过整合肿瘤和生殖系分析，鉴定等位基因并识别影响治疗反应的突变特征，促进了肿瘤基因组图谱的临床应用。我们还讨论了更全面的全基因组和全转录组测序以及游离DNA分析平台的潜在临床应用。
背景介绍
肿瘤是一种遗传疾病，由调节细胞分裂、生存、侵袭或转化的其他特征的基因突变累积形成。由于细胞毒性、免疫和靶向治疗的反应往往伴随肿瘤分子亚型的不同而变化，准确的肿瘤分类是最佳治疗选择的前提。
在这篇综述中，我们讨论了精准肿瘤学临床应用的现状，以及基于NGS大panel产生的位点解读的挑战。图1总结了临床肿瘤NGS在辅助治疗选择、肿瘤亚型诊断和遗传性肿瘤风险评估中的应用。最后，我们展望了更全面的诊断平台的潜在应用，如全基因组、RNA测序和超灵敏的cfDNA分析平台，这些平台可以无创地监测肿瘤复发，并鉴定耐药发生的机制。
图1，肿瘤测序的临床应用
研究进展
DNA突变作为治疗反应的生物标志物
体细胞突变分为肿瘤驱动基因和乘客基因，在这些驱动因素中，有一部分是预测药物反应的生物标记物。精准肿瘤学需要临床医生区分致癌的分子改变与良性变异，并了解个体等位基因突变的生物学差异如何影响患者的治疗反应和预后。目前，大多数临床可操作的突变都是小分子激酶抑制剂或细胞表面抗原的靶点。DNA修复途径中的基因突变也被证明是对细胞毒化疗和免疫治疗反应的预测因子。
变异解读的挑战
精准肿瘤学广泛应用的一个主要挑战是区分功能性突变和良性变异。功能性突变通常表现为酶活性增强或通过二聚化或作为下游效应因子激活肿瘤蛋白信号通路，由于只有一小部分致癌基因的潜在突变能够通过这些机制诱导激活，基于人群的研究已经鉴定了这些突变热点。未能观察到典型的表型并不意味着该突变是良性变异，同一致癌基因的功能获得性突变也可能具有不同的生物学特性，从而导致不同的药物敏感性，这使得临床解释从肿瘤基因组图谱中产生的大量体细胞和生殖系变异具有挑战性。
临床可操作的肿瘤基因组图谱现状
在OncoKB数据库中，1级和2级突变是FDA批准的通过临床试验获得的生物预测标记物(表1)，3级代表临床证据尚不明确的位点，只有实验室证据的位点定义为4级。
表1OncoKB标准治疗的生物标记物
尽管使用NGS来鉴定药物反应标记物一直备受争议，由于需要识别体细胞和生殖系突变，基于NGS的临床肿瘤图谱仍在临床广泛应用。自年以来，与FDA批准的治疗方案相匹配的生物标志物可被肿瘤NGS(OncoKB定义为1级和2级)识别的比例从9%增加到30%(图2b)。虽然FDA最近批准的其他基因型导向疗法显示了一定的研究进展，但识别临床可操作的位点仍然高度依赖肿瘤的类型(图2c)。
目前，精准肿瘤学发展的最大障碍不是NGSpanel中包含的基因数量有限，而是肿瘤基因组图谱中鉴定到的大量“不可用药”的致癌突变。最近关于KRASp.Gly12Cys89的共价抑制剂给新药的开发带来了希望。
图2，目前临床可用的肿瘤基因组图谱
体细胞和种系分析的整合
肿瘤遗传风险和药物基因组学：单基因生殖系检测已逐渐被基于多基因NGS的panel取代，这些panel旨在检测十几个或更多可遗传的肿瘤相关基因的致病生殖系变异。肿瘤和生殖细胞样本的配对分析能准确地将突变分为体细胞变异和种系变异，以识别与遗传性肿瘤风险增加相关的致病种系变异。化疗反应和毒性也与基因的遗传差异有关，影响药物代谢或吸收的种系变异未来有望纳入肿瘤-种系配对NGSpanel中。
克隆性造血：克隆性造血与患者年龄的增加和接受过放疗或细胞毒性化疗有关，克隆造血衍生的体细胞突变可以出现在肿瘤中，前提是等位基因频率高于常规的体细胞突变的阈值。因此，患者在缺乏匹配的种系DNA测序数据(通常来自血液)的情况下，克隆造血源性体细胞突变可能被错误归类为肿瘤体细胞突变。由于等位基因低频突变以及克隆性造血源性突变和肿瘤源性突变的错误分类风险相关，对血浆和白细胞样本进行配对测序分析特别重要。
整合体细胞-种系测序的挑战：尽管种系基因检测的焦点是识别遗传性肿瘤风险相关的变异，但PARP抑制剂在与同源重组修复相关基因突变患者中的成功应用，使得肿瘤和种系基因检测的临床需求趋同。种系突变的其他例子是预测药物反应的生物标志物，包括神经母细胞瘤患儿的ALK突变和甲状腺髓样癌患者的RET突变。导致TMB增加的DNA修复途径的种系突变也与免疫治疗反应有关。作为治疗选择的前提，为肿瘤患者进行广泛的种系基因检测，专家提出了几点担忧，例如针对遗传易感肿瘤患者的歧视风险等。
可选择的肿瘤NGSpanel
全外显子组和全基因组测序：在设计临床NGSpanel时，出于成本的考虑，靶向NGS分析的覆盖深度更高，比WES和WGS更具优势，可以最大限度地检出药物反应的生物标志物。未来的几年里，我们通过WES或WGS肯定会发现其他罕见的致癌融合基因、非编码突变和结构改变。
RNA测序：RNA测序更适合于融合基因检测，也可以提供无法从基于DNA的肿瘤图谱中获得的基因表达信息。然而，对于大多数肿瘤患者来说，从有限的、通常是低质量的肿瘤样本中获得高质量的RNA-seq数据难度较大。作为一种替代选择，基于RNA的panel已经开发出来，使用锚定多重PCR技术，可以从少量FFPE中获得RNA并有效地检测融合基因。外显子组捕获RNA-seq在FFPE肿瘤标本中已显示出了检测融合基因的优势。
Cell-freeDNA：与WES等测序平台相比，能够检测血浆中少量循环肿瘤来源DNA的超灵敏的panel有显著的优势。肿瘤活检样本的数量和质量往往不足以进行肿瘤基因组分析，血浆cfDNA可以通过对肿瘤源性DNA的微创分析来克服这些限制，当患者从局限期疾病进展到转移性疾病或对全身治疗产生耐药时，可连续性地分析肿瘤来源的DNA。基于DNA条形码的测序方法最近被开发出来，用于过滤来自PCR或测序错误的突变(图3)。此外，cfDNA在微小残留病的监测和DNA甲基化检测方面更敏感，有较大的临床应用价值。
图3检测肿瘤游离DNA的低频突变
等位基因信息和突变信号
克隆突变：随着肿瘤侵袭、转移或适应诱导治疗的选择性压力，肿瘤新的突变和结构变异随之出现。因此，患者疾病进展过程中持续的突变和克隆选择形成了病灶内和病灶间的基因组异质性的复杂模式，这可能会降低肿瘤切除的有效性。目前的肿瘤测序报告是以突变为中心的，如肿瘤抑制基因的缺失和易位等(图4a)。
等位基因的信息：基于NGS的肿瘤分析数据推断肿瘤体细胞突变的方法，可鉴定可能影响治疗反应的突变等位基因信息(图4b,c)。许多肿瘤抑制基因只有在两个基因拷贝的双等位基因失活的情况下才有表型(Knudsen双打击假说)。肿瘤抑制基因的双等位基因失活也可能源于表观遗传修饰基因的失调，如启动子甲基化，因此，仅分析基因的杂合性缺失而没有同时检测表观遗传驱动的基因沉默是具有争议性的。
共突变环境：大多数肿瘤测序报告对点突变、拷贝数改变和结构变异(如易位)进行单独解读，引起耐药性或增强药物敏感性的共突变很少被重视。加强对两个或多个共突变位点的解读在未来可能有助于指导治疗选择或改善预后。
突变信号：通过将6种SNV种类与它们的三核苷酸进行排列组合，所有SNV包括96种可能的组合，并确定了81个不同的基于SNV的突变特征，可帮助临床解释潜在的可操作突变。WGS试验也可以准确地鉴定单核苷酸和双核苷酸碱基替换以及小的插入和缺失，这些特征可能比单个肿瘤基因的突变状态更能预测免疫治疗反应或PARP抑制剂反应。
图4扩大肿瘤基因组图谱的临床应用
总结和展望
测序成本的持续下降和预测药物反应的新生物标志物的不断出现，推动了基于多基因肿瘤NGSpanel的快速应用。除了预测治疗反应的生物标志物，肿瘤基因组图谱还可以识别体细胞和种系突变，为临床医生提供对遗传性肿瘤风险、肿瘤复发和死亡的可能性的证据。未来采用更广泛的测序panel或WGS方法能更准确地评估克隆突变特性、等位基因以及识别预测药物反应的突变和结构特征。基于NGS的cfDNA检测平台的出现，为肿瘤治疗后微小残留的评估提供了更多的选择。
文献来源：
