JACS红光引发的近红外探针与细胞质RN [复制链接]

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红光引发的近红外探针与细胞质RNA的交联：一种延长成像时间和实现肿瘤抑制的创新策略

大家好，今天推荐一篇JACS的文章，通讯作者是苏州大学放射与交叉科学学院放射医学与防护国家重点实验室和江苏省高等学校放射医学协同创新中心的石海滨教授。

作为分子成像技术的重要组成部分，分子探针成为准确诊断癌症和有效治疗的一种工具。迄今为止，各种类型的分子探针，包括小分子，大分子，无机纳米材料等等，现如今已经成功开发了用于活体受试者的肿瘤成像和治疗应用的药物。然而，探针在目标疾病区域的积累有限导致诊断和治疗结果变差。为了解决这个问题，通常要服用高剂量的治疗药物。但是血液循环长，肾清除率低和毛细血管渗漏不可避免地会对身体造成严重的副作用。最近，已经报道了刺激介导的自组装方法，以最大化肿瘤治疗剂在肿瘤内的积累和保留，从而改善肿瘤的诊断和治疗功效。许多肿瘤微环境（TME）响应分子可以通过某些刺激（例如与癌症相关的酶，酸性pH，氧化还原，缺氧等等）在肿瘤内局部形成聚集体或纳米颗粒，从而增强成像信号并开发治疗功效。尽管取得了明显的改善，但复杂的生物环境仍不可避免地会导致网状内皮系统（RES）产生不必要的颗粒聚集和大量包裹，从而导致治疗效果不理想。

光作为一种有希望且可控的外部刺激已广泛应用于各种生物医学应用中。例如，作为研究分子与目标分子间相互作用的有效手段，光交联技术是将分子共价结合到目标分子上的有效工具，不幸的是，这种光交联方法在生物系统中的广泛生物学应用受到组织渗透力的限制和紫外线（UV）潜在的光毒性的阻碍。最近开发了一种基于呋喃的多功能红光控制交联化学，用于研究具有时空分辨率的多种生物分子相互作用，然而，尚未开发这种交联策略的体内应用。核糖核酸（RNA）作为中心管道在细胞信息传递和基因调控中起着普遍而重要的作用。大量研究表明，RNA结构的修饰可以诱导下游蛋白的异常表达，从而导致明显的细胞凋亡，这有可能被用于治疗癌症和其他疾病。受此启发，采用这种红光介导的交联方法在时空上操纵肿瘤治疗剂对癌细胞中RNA的锚定，以延长成像和有效的肿瘤治疗，具有重大意义。

在本文中，作者首次报道了一种新型的红光引发的探针-RNA交联（RLIPRC）策略，用于增强肿瘤成像和有效抑制肿瘤。如图中所描绘的方案1中，作者合理设计并合成小分子NIR探针f-CR，它由一个NIR染料（Cy7）的作为荧光信号，特异性结合到一个的cRGD肽αvβ3整联（一个公用的肿瘤靶向的生物标志物），，一旦探针f-CR被选择性地通过所述特定的cRGD的结合内化到癌细胞αvβ3整联，它们可以自发地和通过呋喃和腺嘌呤之间的环加成反应共价交联到细胞质的RNA，体外和体内研究均表明，这种RLIPRC策略可以有效地阻断探针的胞吐作用，从而改善肿瘤的积累和保留。此外，令人惊讶地发现，f-CR可以显着诱导癌细胞凋亡，从而有效抑制4T1乳腺肿瘤。因此，这些独特的功能使探针对于长期的肿瘤成像和抗肿瘤生长非常有利，并为肿瘤治疗学提供了新的方法。

方案1红光引发的f-CR到细胞质RNA的交联，以延长成像和抑制肿瘤的时间

所有化合物最终通过制备性高效液相色谱（HPLC）纯化，并通过高分辨率质谱进行表征。并首次对探针在水溶液中的光学性质进行了表征。如图1b所示，f-CR和CR均显示出基本均匀的吸收和发射曲线，分别在和nm处具有相同的最大峰，这归因于Cy7染料，表明探针具有良好的近红外荧光和PA成像潜力。此外，两亲性探针f-CR由于具有疏水性呋喃和亲水性单元（如cRGD和Cy7），可以在水溶液中自发地自组装成小的纳米粒子。根据透射电子显微镜（TEM）测量，所得纳米粒子的平均尺寸为7.2±0.9nm，如图1c所示，而通过动态光散射（DLS）确定的流体动力学尺寸为8.0±0.9nm。通过吸收测量进一步验证了f-CR粒子的形成。记录了不同PBS缓冲液体积分数下f-CR在DMSO中的吸收光谱。随着PBS组分的增加，f-CR的最大吸光度从nm逐渐蓝移到nm，但当PBS组分增加到90%时，强度保持不变，说明溶剂极性对f-CR的溶解度有很大影响，PBS缓冲液可通过分子间π-π堆积作用诱导f-CR形成H型聚集体。然而，从控制探针CR的TEM图像中未观察到明显的自组装，这可能是由于其良好的水溶性。通过监测f-CR探针的吸收光谱和随时间变化的流体动力学尺寸，研究了f-CR探针在血清溶液中的化学稳定性。

图1探针的化学特性

为了评估红光引发探针对水溶液中RNA的交联能力，合成了一个模型单链小RNA，并选择临床上使用的药物MB作为光敏剂，在激光照射下提供1O2。实验组用nm激光照射含MB（10μM）的f-CR和RNA探针2min，对照组用nm激光照射含RNA和MB探针，f-CR加RNA和MB探针。孵育3min后，用非变性琼脂糖凝胶电泳直接分析，用EB染色（Ex=nm）和凝胶内荧光扫描（Ex=nm）观察。如图2b所示，仅从RNA条带中检测到强荧光信号，而其他对照组几乎没有观察到荧光带，说明f-CR可以通过红光引发的交联反应有效标记合成的RNA，质谱分析进一步证实了这一点。此外，f-CR与RNA的交联效率被证明是1O2依赖的，并且可以通过调整分析中使用的MB浓度（1μM、5μM和10μM）来很好地控制它。综上所述，所有这些证据都有力地证明了在nm激光照射下，呋喃与RNA中腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的NH2基团发生了1O2介导的交联反应。

图2红光诱导探针对RNA交联能力的体外评价

为探讨探针对癌细胞的靶向性，以αvβ3整合素高表达的小鼠乳腺癌4T1细胞为研究对象，以αvβ3整合素低表达的成纤维细胞系3T3为阴性对照。将等量的f-CR探针分别与4T1和3T3细胞孵育3h，然后进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。4T1细胞的红色荧光比3T3细胞高出近3.1倍，说明f-CR对αvβ3整合素过度表达的癌细胞有很强的特异性和靶向性。此外，在37°C下分别对4T1细胞处理相同量的f-CR和CR，进行不同时间（3、6、12和24小时）的培养，然后通过测量细胞裂解物的荧光信号来评估其细胞摄取。两组细胞都观察到强烈的荧光，并且随着培养时间的增加，荧光强度逐渐增强，表明探针f-CR和CR在4T1细胞中具有相似的摄取。接下来，作者研究了光敏剂MB对4T1细胞的光毒性。不同浓度的MB（0.05～μM）与4T1细胞孵育6h，然后用nm激光照射（50mw/cm2，3min）。MTT法测定细胞活力。随着MB处理浓度的增加，MB对4T1细胞的光毒性显著增加。当MB浓度低于0.1μM时，细胞存活率高于98%，说明0.1μM的MB对活细胞是安全的。为了评价MB在nm光照下产生1O2的效率，作者用二氢乙胺（DHE）染色法测定细胞内1O2水平。正如预期的，1O2的产量随着MB浓度的增加而逐渐增加。

为了进一步验证探针f-CR对活细胞RNA的RLIPRC能力，将4T1细胞与f-CR（10μM）和MB（0.1μM）在37℃孵育6h，然后用nm激光照射（表示为f-CR+MB+nm）作为实验组，而用f-CR和MB处理的细胞不经激光照射（表示为f-CR+MB），以CR、MB加nm激光照射（CR+MB+nm）和未经激光照射（CR+MB）的细胞为对照组。如图2c所示，在接受f-CR+MB+nm的细胞中测定到最强的红色荧光。然而，其他三个对照组的细胞仅记录到微弱的荧光，这意味着探针f-CR在nm激光照射下提高了细胞的摄取。此外，所有四组4T1细胞同时接受SYTORNASelect绿（一种商业RNA染色剂）处理，然后用CLSM处理。与三个对照组相比，f-CR+MB+nm组的f-CR（红色）和RNA染色（绿色）明显重叠。通过定量分析细胞图像的重叠度，发现f-CR+MB+nm和f-CR+MB的共定位率分别为63.4%和18.9%，而CR+MB+nm组和CR+MB组的共定位率仅为10.1%和3.6%（图2d），这主要是由于固定化的f-CR探针的RLIPRC效应在细胞内的rna上。接下来，为了研究f-CR探针的细胞定位，将接受f-CR+MB+nm的细胞分别处理为lysotrackergreen、mitotrackergreen和ER-tracker-blue。由于内质网（ER）是RNA翻译和蛋白质合成的主要细胞器，发现f-CR的红色荧光与ER跟踪器（蓝色）的共定位性最好，表明f-CR主要位于细胞内质网。此外，分别用胞质和细胞核纯化试剂盒提取细胞质和细胞核中的RNA，用RNA非变性琼脂糖凝胶电泳、凝胶内荧光扫描和溴化乙锭（EB）染色进行分离。如预期，f-CR+MB+nm组的细胞质RNAs观察到强烈的荧光带（图2f）。在相同条件下，用RIPA裂解缓冲液分离各组细胞总蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，荧光扫描。所有样品均未观察到荧光），表明f-CR和细胞内蛋白质之间没有反应性。综上所述，所有这些证据都有力地表明，在光敏剂存在下，红光可以时空诱导活细胞中f-CR与细胞质RNA的交联。

图34T1细胞和荷瘤裸鼠的CLSM成像

为了进一步评价f-CR在癌细胞中的增强摄取和长时间停留的特性，将4组4T1细胞预处理至MB（0.1μM），然后用f-CR或对照探针CR（5μM）在37°C下孵育6h，然后用nm激光照射（50mW/cm2，3min）。图3a所示的CLSM图像表明，在初始阶段，四组细胞的荧光强度几乎相同。相比之下，接受CR+MB、CR+MB+nm和f-CR+MB的细胞的荧光随着时间的推移迅速衰减，而f-CR+MB+nm的细胞即使在48小时内仍保持较强的荧光（图3a），图3b所示的定量结果进一步证实了这一点。培养48小时后，具有f-CR+MB+nm的细胞仍保持约51%的初始荧光信号。与此形成鲜明对比的是，其他三个对照组的细胞保留了低于4%的初始信号。这可能是由于红光引发的f-CR探针与细胞质RNAs交联，从而提高了对癌细胞的摄取并延长了其在癌细胞中的停留时间。进一步评价了f-CR的RLIPRC效应。首次验证了用nm激光照射MB产生1O2。简而言之，将MB（50μL，0.1μM）注射到皮下4T1荷瘤BALB/c小鼠体内。肿瘤在注射后1.5h暴露于nm激光（50mw/cm2）3min后，用DHE染色法检测1O2。在注射后1小时，肿瘤区域暴露于nm激光3分钟，然后使用IVIS光谱进行NIR成像（图3c）。图3d显示了用f-CR治疗的各种肿瘤与对照组的时间依赖性荧光图像。各组肿瘤在最初的1h内表现出几乎相同的高荧光，随着时间的推移，各组肿瘤的荧光信号逐渐衰减。对照组肿瘤经CR+MB、CR+MB+nm和f-CR+MB处理后，由于肿瘤清除迅速，荧光强度急剧下降。而f-CR+MB+nm组在各记录时间（3h、6h、12h、24h）荧光均明显高于对照组，定量分析进一步表明，接受f-CR+MB+nm照射的肿瘤在24h仍保留了1h的26%的荧光信号，而其他三个对照组的荧光强度均小于1%（图3e）。

同样，图4a中的活体光声（PA）成像显示，所有肿瘤组在1小时时的PA强度几乎相同。与三个对照组相比，接受f-CR+MB+nm的肿瘤在24小时内明显保持较强的PA信号，对肿瘤区域平均PA信号的定量分析表明，在24小时，f-CR+MB+nm的肿瘤比其他三组高出50倍（图4b），表明1O2启动了f-CR探针与细胞质的交联在nm光照下发生RNAs。进一步检测注射后12h肿瘤组织的荧光信号。图4c显示，接受f-CR+MB+nm处理的小鼠肿瘤组织，其荧光强度在各组中明显最强，这与上述体内近红外图像相当一致。此外，体外生物分布研究表明，即使在12小时后，实验组肿瘤的荧光强度也比其他对照组高6倍左右（图4d）。总的来说，这些结果有力地证明了这种RLIPRC方法可以显著地改善探针f-CR在肿瘤中的积累和保留，用于长期肿瘤成像。

图44T1肿瘤的活体光声成像及探针在小鼠体内的分布

为了验证上述假设，用一种市面上可买到的GFPmRNA作为模型RNA，研究f-CR探针对活细胞中GFP表达的影响。分别用PBS单独处理GFPmRNA（表示为对照组）、探针CR和MB的混合物（表示为CR+MB）、CR和MB的混合物接着nm照射（表示为CR+MB+nm）、探针f-CR和MB的混合物（表示为f-CR+MB）和探针f-CR和MB的混合物接着nm照射（表示为f-CR+MB+nm）。然后用Hieff反式脂质体转染试剂将这些预处理的GFP-mRNAs转染到不同组的4T1细胞中。培养24h后，用共聚焦显微镜和流式细胞仪分析GFP的表达效率。如图5d，e所示，与其他4个对照组细胞相比，f-CR+MB+nm的细胞绿色荧光明显较低，表明GFP表达较低。因此，作者推测经f-CR探针修饰的细胞质RNA的生物学功能可能受到干扰，导致蛋白表达异常，导致细胞严重凋亡（图5f）。

图5探针对4T1癌细胞毒性作用的体内外评价

进一步验证了f-CR探针的体内抑瘤性能。相比之下，接受f-CR+MB+nm的肿瘤在第13天明显缩小，肿瘤抑制率约为70%。对照组小鼠的肿瘤体积和体重比实验组大2倍（图6c）。在nm激光照射后48h提取肿瘤组织，进行苏木精-伊红染色。肿瘤切片定性组织学检查显示，3个对照组肿瘤均未见明显恶性坏死，而f-CR+MB+nm组明显坏死率最高。用TUNEL法和活化caspase-3免疫组织化学染色法检测肿瘤细胞凋亡程度。与三个对照组相比，在接受f-CR+MB+nm的肿瘤组织中检测到明显的DNA损伤和高水平的活化caspase-3表达（图6d），表明肿瘤细胞增殖受到有效抑制。这有力地证明了红光探针对肿瘤细胞的治疗作用。

图6体内肿瘤抑制的评价

综上所述，本文首次采用红光引发的位点特异性交联策略来增强肿瘤成像，实现肿瘤抑制。体外和体内研究表明，f-CR探针具有很强的肿瘤靶向能力，能发出强烈的NIR/PA双模信号，能够对体内肿瘤进行特异、灵敏的观察。值得注意的是，在nm激光照射MB产生的1O2氧化作用下，该探针可与胞质RNA特异性交联，从而显著提高探针在肿瘤中的积累和保留，从而延长肿瘤显像时间。更令人惊讶的是，f-CR探针与细胞质RNA共价交联可显著诱导细胞凋亡，从而显著抑制肿瘤。

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