CRISPRCas基因编辑技术原理及在肿 [复制链接]

CRISPR/Cas基因编辑技术原理及在肿瘤靶向治疗和免疫治疗研究中的应用

什么是CRISPR/Cas?

TheNobelPrizeinChemistryGoesTOCRISPRGeneEditing

什么是CRISPR/Cas?

·细菌和古细菌的天然获得性免疫系统防止病毒和质粒入侵

·CRISPR:Clusteredreqularlyinterspacedshortpalindromicrepeat,规律成簇间隔短回文重复序列

·Cas:CRISPRassosciated-

切割(导弹)Cas基因

识别(导航)CRISPR序列

CRISPR/Cas系统是如何工作的？

第一阶段:外来DNA采集

通过Cas识别外源核酸，将其短片段插入宿主CRISPR位点

CRISPR/Cas系统是如何工作的？

第二阶段:合成CRISPRRNA

转录加工生成crRNA及tracrRNA

为什么需要CRISPR/Cas?

siRNAshRNA

ZNFTALEN

改变基因

1)Lossfunction:降低基因或删除基因

2)Givefunction:提高基因的表达

3)Mutationknockin:定点突变

怎么用CRISPR/Cas？

·DNA识别结构:RNA二聚体tracrRNA::crRNA）

·口靶序列切割酶:Cas9（Ⅱ类CRISPR--cas系统）

表达两个元件-组装-定位-切割-修复-突变！！！

CRISPR/Cas系统发现历程

CRISPR应用1

特定基因敲除

·设计sgRNA

·WB验证敲除效果

·测序确定突变细节

CRISPR应用2

特定染色质片段删除

·设计sgRNA

·PCR检测目的片段是否删除

CRISPR应用3

引入突变、标签、或条件敲除元件

·引入突变

·引入标签

·引入条件敲除元件

CRISPR应用4

调控基因表达

核酸活性失活dCas9

转录激活

·转录激活因子VP64.p65等

·组蛋白乙酰化酶p等

·DNA去甲基化酶TET1等

转录抑制

·转录抑制结构域KRAB等

·蛋白去甲基化酶L5D1等

·DNA甲基化DNMT3A等

CRISPR应用5

活细胞染色质特定位点标记（CRISPRimaging）

·dCas9与荧光蛋白结合

MatlabMSD均方位移统计特定染色质位点动力学变化

·sgRNA将荧光白带到兴位点

·活细成像拍福荧光亮移动轨迹

CRISPR应用6

高通量筛选肿瘤细胞耐药基因/发现协同致死基因

·筛选流程

·耐药细胞进化线TOP富集基因展示

·耐药基sgRNA富集变化

CRISPR与肿瘤免疫

1.揭示已知靶点调控机制或耐药机制

体内全基因组CRISPR筛选寻找anti-PD-1治疗协同增效靶点

小鼠体内筛选流程示意图

靶基因功能验证

2.寻找免疫治疗新靶点

全基因组CRISPR筛选肿瘤细胞抵抗T细胞杀伤的基因

靶基因功能验证

筛选流程示意图

3.高效构建更安全的CAR-T细胞

CRISPR/Cas9定向插入CAR基因，递送到基因组特异性位置，确保CAR-T疗法更安全，更有效

3.构建更有效的CAR-T细胞

CRISPR/Cas9敲除T细胞中的PD-1再回输给病人进行免疫治疗

正在开展的CRISPR-肿瘤免疫治疗相关临床试验

挑战和展望

·CRISPR本身脱靶效应，递送效率

·体内安全性，有效性

·新的靶点的发现。

染色质动态重塑与肿瘤免疫治疗

CRISPR文库筛选调控染色质动态重塑的基因

筛选流程示意图

染色质动态重要reporter

筛选结果分析

染色质动态重塑与肿瘤免疫治疗

敲低Tx激酶显若促进PD-1抗肿瘤效果（抑制肿瘤转移？）

是否抑制肿瘤转移？

增强anti-PD-L1抗肿瘤效果。

CRISPR高通量筛选

?HumanGeCKO全基因组文库

?HumanKinome激酶文库

?HumanTKO全基因组文库

?HumanEpiome表观文库

?HumanSAM全基因组激活文库

?HumanTFome转因子文库

?HumanMitocheck有丝分文库

如何做CRISPR筛选？

拿到筛选数据后？

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