JCR肿瘤来源的外泌体能够特异性的预防癌 [复制链接]

外泌体是由细胞产生并释放的细胞外纳米大小的囊泡，参与许多细胞间的通信和细胞间物质的运输。研究发现，在外泌体表面存在多种表面生物标志物，包括四种表面蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82)和表皮生长因子受体(EGFR;ErbB-1;人类HER1)。这些表面生物标志物对于各种治疗(小分子、适配体和抗体)的精确靶向递送起着至关重要的作用。癌症来源的外泌体可以通过与特异性器官上的整合素相互作用，促进肿瘤转移前期的发展。在癌症的转移过程中，优先向某些器官或者组织发生转移，被称为癌症转移的“器官向性”（organ-specificmetastasis）。越来越多的证据表明，器官向性受多种因素调节，包括肿瘤自身或外泌体等内在因素以及器官特异性、微环境之间的相互作用等外在因素。

为了有效的干扰肿瘤细胞的转移同时抑制肿瘤的生长，来自福建福州闽江大学海洋研究所、福建省肿瘤转移化学预防与化疗重点实验室的贾力教授及其团队将最新的研究成果发表在JournalofControlledRelease,题目为“Tumor-derivedexosomescanspecificallypreventcancermetastaticorganotropism”

如图1A所示，从人乳腺癌MDA-MB-细胞中提取出外泌体，并对其进行修饰和载药，制备成含药纳米粒子（DOX-EXO）后再通过尾静脉注射到小鼠体内。体内外实验结果表明，DOX-EXO能够有效的抑制肿瘤细胞生长，抑制肿瘤的转移。

图1.EXO和EXO-DOX的制备程序和生物物理特性。（A）EXO-DOX的体外制备及其体内递送至靶器官肺的过程；（B-C）EXO和EXO-DOX的大小和形态；（D-E）透射电子显微镜显示了EXO和EXO-DOX的形态；（F）EXO和EXO-DOX的粒径大小分布；（G）CD9和CD63在EXO的表达。

DOX-EXO的生物物理特性及表征如图1B-G，可观察到粒子的形态大小稳定，载药后性质无明显变化。补充实验中表明体外药物释放的速率也符合给药要求。

为了考察不同器官对MDA-MB-来源的外泌体的摄取情况，研究人员将PKH67标记的DOX-EXO与肝Lo2细胞和肺Helf细胞共同孵育，结果如图2所示，Helf细胞对EXO的摄取比Lo2细胞高2.7倍，这种差异可能是由EXO和Helf细胞之间的高亲和力造成的。为了确定MDA-MB-细胞来源的外泌体能够将DOX带入细胞，研究人员在MDA-MB-细胞孵育后，分别测量了细胞内的EXO-DOX和free-DOX水平。荧光显微镜分析显示MDA-MB-细胞对游离DOX和EXO-DOX的摄取几乎相同(如图2E-G)，因此，将DOX包被于EXO中，不会改变其跨膜转运和对靶细胞的抑制作用。为了确定在EXO和肺细胞之间是否存在特异性识别，敲除了EXO上的ITGB4，并比较了Helf对EXO-DOX和ITGB4-KO-EXO-DOX的吸收。发现如果将ITGB4基因敲除，则会显著降低Helf细胞对EXO-DOX的摄取。

图2.外泌体的细胞摄取。(A)Lo2细胞和Helf细胞体外摄取EXO的示意图；(B)共聚焦显微镜结果显示Lo2和Helf细胞摄取EXO(蓝色)；(C)摄取的定量分析；(D)流式细胞术结果显示Lo2和Helf细胞摄取EXO；(E-F)MDA-MB-细胞对DOX和EXO-DOX的摄取；(G)MDA-MB-细胞对DOX和EXO-DOX的摄取定量；(H-I)流式细胞术(H)和定量(I)显示ITGB4-KO-EXO-DOX、EXO-DOX和freeDOX被Helf细胞摄取。

外泌体表面蛋白CD47能够阻止外泌体被免疫系统清除，如果对CD47进行敲除，体内的巨噬细胞对外泌体的摄取就会增加。如图3所示，CD47-EXO对巨噬细胞吞噬的敏感性降低证实了CD47具有免疫逃避功能，可以延长外泌体在体内的循环时间。

图3.CD47增强外泌体循环。(A)原理图表明，外泌体上CD47的存在有助于外泌体逃脱免疫细胞的攻击；(B)CD47在EXO和CD47-KO-EXO上的表达；(C-D)流式细胞术显示巨噬细胞在孵育3小时后摄取CD47-KO-EXO和CD47+EXO的情况；(E-G)小鼠尾静脉注射3h后血液中CD47+EXO(E)和CD47-KO-EXO(F)的含量及相关定量分析(G)。

为了确定设计的EXO-DOX是否能够穿过血管生物层并到达靶点，研究人员建立了Transwell模型来评估其运输能力(图4A)。通过共聚焦显微镜测量下腔受体细胞对EXO-DOX的吸收量(图4B)能够证明EXO-DOX可以穿过血管生物层，并被受体癌细胞在转移部位摄取。此外肺部的免疫荧光染色切片证实了巨噬细胞和上皮细胞吸收了EXO-DOX。

图4.EXO-DOX在体外和体内的分布。(A)EXO-DOX在Transwell膜上腔的跨内皮迁移；(B)Transwell对MDA-MB-来源的EXO-DOX的体外摄取；(C)尾静脉注射3h后小鼠肺内分布的EXO-DOX免疫荧光分析。

为了研究外泌体在体内的靶向分布，研究人员分别用了DOX-EXO和ITGB4-KO-EXO，结果发现（如图5所示），ITGB4高表达的EXO在肺中的积累高于肝脏(4倍)，而ITGB4-KOEXO在肺中的积累较少，在肝脏中的积累增加。这一结果表明，外泌体ITGB4可以与EXO在肺内的器官特异性分布有关。由于EXO和EXO-dox具有相同的ITGB4表达，因此它们在类似的靶向药物传递中具有相同的生物分布。为了确定EXO和EXO-DOX在体内的分布，我们在小鼠体内进行了相关体内实验，如图6所示，研究人员观察到EXO和EXO-DOX在肝和肺中的比值在1左右，说明EXO和EXO-DOX在肺和肝中的生物分布是相同的。然而，EXO(ITGB4阳性)和He-EXO-DOX(ITGB4阴性)在肺和肝中的生物分布是不同的。这些结果表明，外泌体表面ITGB4是EXO-DOX器官靶向性的关键因素，通过这种靶向性，EXO-DOX可以特异地靶向给药部位。

图5.ITGB4在外泌体肺向器官性中的作用。(A)示意图显示了EXO(主要是肺)和ITGB4-KOEXO之间不同的向器质性；(B)ITGB4在EXO、NC(正常对照)和ITGB4-KOEXO上的表达；(C)注射3h后，PHK67标记的EXO/ITGB4-KOEXO(绿色)在小鼠肝脏和肺部的分布；(D）注射3小时后定量EXO和ITGB4-KOEXO在小鼠肝脏和肺部的体内分布。

图6.EXO和EXO-DOX的体内分布。(A)PHK67标记的EXO(绿色)和EXO-DOX/He-EXO-DOX(红色)在小鼠肺和肝脏中的表达；(B)静脉注射后，EXO(ITGB4阳性)和He-EXO-DOX(ITGB4阳性)在肝脏和肺部的分布比例。

最后研究人员对EXO-DOX的体内抗肿瘤活性和抗肿瘤转移的能力进行了分析，结果如图7所示。肿瘤血管生成是转移形成的关键，EXO-DOX可以抑制血管生成。而EXO对血管生成没有影响，这说明EXO-DOX对血管生成的影响是由DOX发挥作用的。体内活性实验结果清晰可见，图7E-F为乳腺肿瘤肺转移灶，EXO-DOX组的肺转移明显少于其他组。此外，研究人员还测量了原发肿瘤的体积(图7H)。EXO-DOX组与对照组肿瘤大小无显著差异。这可能是因为低剂量的EXO-DOX对移植瘤的生长没有明显影响。

图7.EXO-DOX的器官靶向性能防止MDA-MB-细胞转移到肺。(A)DOX和EXO-DOX对MDA-MB-细胞培养48h后的细胞毒性；(B)EXO、EXO-DOX和free-DOX对血管形成的影响；(C)平均内皮管长度；(D)将MDA-MB-细胞皮下植入小鼠，然后在指定的时间点静脉注射PBS、EXO、DOX和EXO-DOX；(E)照片和(F)从皮下植入肿瘤分离出来的循环MDA-MB-细胞引起的肺转移性结节(箭头所示)的定量；(G)肿瘤的肺HE染色；(H)皮下植入肿瘤的体积。

总之，本研究设计了一种肿瘤来源的外泌体作为递药平台负载DOX抑制原位肿瘤EXO引起的转移。从一系列体内外实验中可以看出EXO-DOX对乳腺荷瘤小鼠的肺转移有明显抑制作用，但对原发肿瘤的大小没有明显的改善。为外泌体在药物递送方面的应用提出了新的策略和思路。