HBVHCV相关肝细胞癌的全球免疫特 [复制链接]

肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的第四大主要原因，慢性乙型肝炎（HBV）和丙型肝炎（HCV）病毒感染是主要的危险因素。最近的免疫疗法，包括阻断免疫检查点的抑制剂，在HCC中显示出令人鼓舞的临床结果。然而，治疗结果的患者中会发生变化，只有约20％的反应率达到。肝癌被称为炎症驱动性疾病，免疫细胞浸润和动态相互作用的质量和数量可能会显着影响免疫疗法的功效4是合理的。

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的异构生态系统。先天免疫细胞，例如经典激活的巨噬细胞（M1）可以杀死并清除肿瘤细胞，而M2巨噬细胞，也被认为是肿瘤相关的巨噬细胞（TAM），可以促进肿瘤进展。尽管目前很清楚，巨噬细胞在肿瘤免疫反应中起着双重作用，但异质性，功能特征以及M1和M2巨噬细胞之间的关系仍需要进一步表征。而且，TME中的适应性免疫细胞的各种子集在抗肿瘤反应中显示出可塑性。例如，CD8+细胞毒性T细胞在肿瘤控制中起关键作用，有助于更好地预后HCC。然而，这些细胞可能会由于持续的抗原刺激而显示出疲惫状态，并显示出产生促炎性细胞因子能力受损。因此，多种免疫亚群的全面表征将为发展肿瘤免疫疗法带来新的线索。

我们对从七个未治疗的HCC（P01?P07）和邻近的非肿瘤肝组织分离的免疫细胞进行了scRNA-seq。除一名HCV感染者（P05）外，所有患者均被HBV感染，其中I期3例，III期4例。共有41,个细胞通过了质量控制，包括来自非肿瘤肝组织的21,个细胞和来自肝癌的19,个细胞，平均每细胞UMI和个基因/单元。我们使用了SingleR算法15将细胞分组为主要免疫细胞类型，并通过t分布随机邻居嵌入（t-SNE）进行可视化。我们确定了八个免疫亚组，它们具有众所周知的标记基因的表达。与先前的数据12一致，T细胞是肿瘤中最丰富的免疫细胞类型（36.20％），其次是NK（28.57％）和巨噬细胞（25.04％）。尽管检测到的树突状细胞（DC）的数量最少（1.19％），但其中的UMI和测序的基因数量最多（16,UMI/细胞和基因/细胞）。

骨髓细胞由各种亚组组成，在肿瘤免疫中表现出独特的功能。为了进一步研究HCC中的髓样种群，无监督的个髓样细胞簇清楚地揭示了八个不同的簇

在我们的数据中，M?_c1代表最丰富的巨噬细胞（37.10％），IL1B以及CXCL10和CXCL9高表达，可能参与抗肿瘤反应。一致地，这些巨噬细胞表达更高水平的IFN-γ相关基因，例如TNFAIP3，GBP1，APOBEC3A和GBP5。M?_c2和M?_c3（分别为13.54％和13.31％）被认为是库普弗样细胞，这是由于它们的VSIG4（组织特异性巨噬细胞特有的膜蛋白）更高的表达。值得注意的是，M?_c4（11.16％）在晚期HCC患者（P04和P07）中大部分浸润，其特征是CCL18的表达较高，而以前的scRNA-seq研究中却没有。这些巨噬细胞在脂质转运和代谢以及免疫抑制相关途径中显示出强活性。我们证实，CCL18主要由M2巨噬细胞分泌，HCC患者在肿瘤中表现出较高比例的CD68+CD+CCL18+巨噬细胞，与大肿瘤大小相关（P?=0.），晚期TNM分期（P?=0.;补充表S4），以及我们队列中的生存率较差。M?_c5-M?_c7具有很强的供体表型，被定义为单核细胞来源的抑制细胞（M-MDSC，分别为8.78％，8.16％和7.95％），其特征在于SA12，SA9和SA8的高表达，以及CCR2，这可以促进其贩运到肿瘤部位。特别是，M?_c7大多来自P06衍生，一个36年男性患者，HBVDNA（,IU/毫升）的高负载时，显示的上调IFI44L和IFI6，暗示在抗病毒反应的潜在作用。我们只回收了DC（DC_c1）的一个子集，该子集具有丰富的表达CLEC9A和XCR1的能力，这是抗原呈递cDC1细胞的标志，部分原因是样品偏倚或不同的组织消化方法。cDC1细胞通过呈递抗原22在激活T细胞中起重要作用。正如预期的那样，DC_c1标记基因表达增加的HCC在TCGA队列中具有更好的生存率（P?=0.）。有趣的是，DC_c1在与RNA和蛋白质代谢以及DNA复制有关的途径中富集，暗示它们的转录上调，这与它们拥有最多基因的发现相一致。此外，由于TME的重塑，DC_c1细胞可能具有功能改变和脂质利用增加，因为与非肿瘤对应物相比，CXCL9，IDO2，APOA2和APOE的表达增加.

巨噬细胞在表型和功能上是可塑性的，但是巨噬细胞极化的模型仍然存在争议。我们评估了M?_c1-M?_c4中M1和M2签名基因的表达，以定义它们的表型，并执行Monocle2算法23揭示了它们的潜在转变。结果表明，M?_c1和M?_c4在表型上分别更像M1和M2巨噬细胞，而M?_c2和M?_c3出现在中间阶段。从M1到M2状态的转变过程中，巨噬细胞获得了通过上调基因（例如MMP14）促进肿瘤侵袭，转移和免疫抑制的功能，VEGFA和MRC1。但是，尽管巨噬细胞逐渐获得了M2表型的特征，但它们并未明显下调M1信号。这一发现表明，M2如巨噬细胞仍然保持一些抗肿瘤特性，支持认为，在TME巨噬细胞活化没有按照经典偏振图案。

巨噬细胞可能会改变代谢基因的表达以适应能量需求，例如增加的脂肪酸氧化为M2极化提供了关键的能源。我们发现，与M1巨噬细胞相比，M2巨噬细胞显示出逐渐增强的脂质代谢，例如M?_c2-M?_c4中的高表达TREM2，这是M2巨噬细胞的标志基因。此外，肿瘤中的M2巨噬细胞显示出比非肿瘤中更强的脂质代谢特征，表明TME可能增强M2巨噬细胞中的脂质代谢。脂质代谢相关基因FABP5，ABCA1，SCD和PLTTP在M2巨噬细胞亚群中异质表达，表明不同M2亚群之间的代谢异质性。着眼于M?_c4中最接近M2的巨噬细胞，我们发现转录因子CREM在该簇中表达更强，并且通过单细胞调节网络推断和聚类（SCENIC）分析，其靶基因在M?_c2-M?_c4巨噬细胞中也高度上调。。CREM能够结合IL2启动子以减少其在T细胞中的产生，但是，CREM是否在巨噬细胞中表达尚不清楚。我们进一步证实，通过流式细胞术，CREM在肝癌的M2巨噬细胞中显着上调，其确切角色需要功能研究。

NK细胞在表型上定义为CD56+和CD56-，它们在TME中起不同的作用。近日，NK细胞的几个新的子集已确定由血液scRNA-SEQ和非肿瘤患者脾，这意味着NK细胞的组织相关的多样性。我们通过无监督聚类确定了NK细胞的六个子集（14,个细胞）。NK细胞的免疫亚群具有高度的供体特异性，这可能反映了个体之间遗传起源或对不同TME的适应性差异。NK_c3和NK_c5主要来自非肿瘤肝组织（分别为23.57％和5.97％），衍生和特征是转录因子，例如高表达FOS，FOSB，FOXP1，和ATF4，以及参与两个基因NF-κB途径，NFKBIA和NFKBIZ。此外，如前所述，NK_c5主要来自高负荷HBVDNA的P06，由于它们特异性表达IFI44，IFI44L和MX1等抗病毒相关基因，因此可能发挥额外的抗病毒作用。非乙肝病毒感染者的数量。一致地，NK_c5高表达STAT2，IRF9和IRF7，它们有助于多种病毒诱导基因的转录激活。此外，我们还恢复了一个末端NK亚集（NK_c1，标记基因：LAIR2，IGFBP7和CD55为27.66％），一个用尽的NK子集（NK_c4，标记基因：LAG3，PTMS和SA6为13.55％）和两个未定义的NK子集（NK_c2，标记基因为TOX2，CXCR6和XCL1占23.81％）和NK_c6，标记基因：MYOM2，CX3CR1和PRF1，为5.60％。我们发现NK细胞主要形成了两个截然不同的亚组为NK_c1，NK_c4和NK_c6强烈表达的细胞毒性有关的基因一样GZMB，GNLY，FGFBP2和FCGR3A（CD16），而NK_c2，NK_c3和NK_c5高表达的GZMK，CXCR6和CD69是CD56亮组织驻留NK细胞的标记基因。然后，我们比较了这些NK亚群的CD56的表达谱亮和CD56暗淡基因表达程序澄清由Hanna等人定义的它们的属性。33。结果显示NK_c1，NK_c4和NK_c6更像CD56昏暗的NK细胞，而FCM证实这些NK细胞中颗粒溶素，颗粒酶B，KIR2DL1和CX3CR1的表达更高。其强大的细胞毒性功能。有趣的是，NK_c1和NK_c4也像NK_c3和NK_c5一样在CD56亮标记中得分较高，这意味着NK细胞的免疫调节作用不仅限于CD56亮细胞，并且常规的NK细胞分类并不适合所有NK亚群。我们还鉴定CD56的连续方法暗淡从CD56转化的NK细胞明亮的NK细胞，支持的概念，即CD56明亮的NK细胞是CD56的前体暗淡NK细胞30。CD56亮NK细胞表达较高水平的膜受体（例如CXCR6，CD和KLRC1）以及趋化因子（例如XCL1和XCL2），表明它们在TME中具有免疫调节作用。膜受体如FCGR3A和CX3CR1的表达以及细胞毒性基因如GZMB，FGFBP2，PRF1，和GNLY逐渐这个转变期间增加，这意味着在一个CD56逐渐获取肿瘤杀伤能力暗淡NK细胞。

我们检测个CD8+T细胞和重新聚集到五个亚群+T细胞（CD8_c1，标记基因：FGFBP2，GZMB，和GNLY，48.17％），MAIT细胞（CD8_c2，标记基因：SLC4A10，KLRB1，和ZBTB16，31.91％），耗尽CD8+T细胞（CD8_c3，标记基因：CTLA4，HAVCR2，和PDCD1，7.51％），活化XCL1+CD8+T细胞（CD8_c4，标记基因：XCL1，XCL2和ITGAX，占6.19％）和中央记忆CD8+T细胞（Tcm，CD8_c5，标记基因：CCR7，SELL和GPR，占5.34％）。

我们专注于CD8_c4，XCL1我们的分析+CD8+T细胞，因为这簇没有在HCC特点是以前scRNA-SEQ研究12，13。据报道，CD8+T细胞在被激活时可以分泌XCL1，然后募集XCR1+DC细胞用于抗原呈递34。数据显示CD8_c4T细胞表达高水平的记忆标记物（如ITGA1和CD7），以及识别MHCI类分子的基因，例如KLRC2，KIR2DL3和KIR3DL2，暗示它们在抗原识别和免疫激活中的重要作用。最近，XCL1在组织驻留记忆CD8+T细胞（C5_CD8-GZMK）的子集中显示出上调，并通过先前在HCC13中的scRNA-seq研究显示出可能的“精疲力竭”状态。但是，在我们的数据中，由于XCL1+CD8+T细胞的XCL1表达更加特异性且GZMK表达相对较低，因此它形成了与CD8+GZMK+T细胞不同的子集。我们检查了XCL1的表达在该子集中通过多重IHC（mIHC）排除了NK细胞，因为它们也可以分泌XCL1。在我们的队列中，我们证实存在大量分泌XCL1的CD3+CD8+T细胞的一个子集，并且这些细胞而不是NK细胞密度更高的患者预后更好。接下来，我们评估了CD8+T细胞的发育过程。CD8_c1细胞（效应CD8+T细胞）和CD8_c3细胞（耗尽的CD8+T细胞）位于轨迹的相对两端，而CD8_c4和CD8_c5的活化和TcmCD8+T细胞位于中间。此外，效应CD8+T细胞比其他三种类型表现出更多的分支，表明它们在抗肿瘤反应中具有更大的异质性。我们研究了其表达水平随着疲劳而逐渐增加的基因。除了已知的耗尽标记（例如CTLA4）之外，PDCD1，TIGIT，HAVCR2和LAG3是FABP5，TRPS1，CREM和CEBPD等可能潜在促进CD8+T细胞衰竭的靶基因。

TME中的细胞间相互作用对于肿瘤的发生和发展至关重要。我们进行了CellphoneDB分析，以阐明免疫亚群之间的相互作用，并确定了特异性针对肿瘤的相互作用。结果表明，参与免疫激活和抗肿瘤反应的相互作用（例如CXCL9-CXCR3，CXCL9-DPP4，XCL2-XCR1和TNFSF4-TNFRSF4）在肿瘤中上调，部分是由于持续刺激肿瘤抗原所致。有趣的是，我们发现肿瘤中的各种免疫抑制相互作用也被上调。例如，CCR1+我们先前的研究揭示了单核细胞可促进HCC的免疫逃逸，在这里我们还发现巨噬细胞衍生的CCL18可以与受体CCR1形成自我反馈，从而潜在地促进了肿瘤的免疫抑制。而且，诸如CD80-CTLA4，CD86-CTLA4和LGALS9-HAVCR2之类的相互作用大多富含肿瘤，这意味着这些相互作用可能共同有助于免疫逃逸。此外，与肿瘤血管生成有关的相互作用，例如NRP1-VEGFB，ADRB2-VEGFB和NRP1-VEGFA在肿瘤中被广泛回收，表明它们在促进肿瘤血管生成中的潜在作用。